Univerzálny SYBR GREEN qPCR Premix (modrý)
Kat. číslo: HCB5041B
Univerzálna modrá qPCR Master Mix (Dye Based) je predroztok pre 2× kvantitatívnu PCR amplifikáciu v reálnom čase, ktorá sa vyznačuje vysokou citlivosťou a špecifickosťou, je modrej farby a má efekt sledovania pridania vzorky.Hlavná zložka Taq DNA polymeráza využíva horúci štart protilátky na účinnú inhibíciu nešpecifickej amplifikácie v dôsledku žíhania priméru počas prípravy vzorky.Súčasne vzorec pridáva podporné faktory na zlepšenie účinnosti amplifikácie PCR reakcie a vyrovnanie amplifikácie génov s rôznym obsahom GC (30 ~ 70%), takže kvantitatívna PCR môže získať dobrý lineárny vzťah v širokom kvantitatívnom rozsahu. regiónu.Tento produkt obsahuje špeciálne ROX Passive Reference Dye, ktoré je použiteľné pre väčšinu qPCR prístrojov.Nie je potrebné upravovať koncentráciu ROX na rôznych nástrojoch.Je len potrebné pridať priméry a templáty na prípravu reakčného systému na amplifikáciu.
Komponenty
Univerzálna modrá qPCR Master Mix
Podmienky skladovania
Výrobok sa dodáva s ľadovými obalmi a môže sa skladovať pri teplote -25 °C ~ -15 °C po dobu 18 mesiacov.Pri skladovaní alebo príprave reakčného systému je potrebné vyhnúť sa silnému ožiareniu svetlom.
Špecifikácia
| Koncentrácia | 2× |
| Metóda detekcie | SYBR |
| PCR metóda | qPCR |
| Polymeráza | Taq DNA polymeráza |
| Typ vzorky | DNA |
| Aplikačné vybavenie | Väčšina nástrojov qPCR |
| Typ produktu | SYBR premix pre fluorescenčnú kvantitatívnu PCR v reálnom čase |
| Použiť na (aplikáciu) | Génová expresia |
Inštrukcie
1.Reakčný systém
| Komponenty | Objem (μL) | Objem (μL) | Konečná koncentrácia |
| Univerzálny SYBR GREEN qPCR Premix | 25 | 10 | 1× |
| Forward Primer (10 μmol/l) | 1 | 0,4 | 0,2 μmol/l |
| Reverzný základný náter (10 μmol/l) | 1 | 0,4 | 0,2 μmol/l |
| DNA | X | X | |
| ddH2O | až 50 | do 20 | - |
[Poznámka]: Pred použitím dôkladne premiešajte, aby ste zabránili vzniku nadmerných bublín spôsobených silným pretrepávaním.
a) Koncentrácia priméru: Konečná koncentrácia priméru je 0,2 μmol/l a môže byť podľa potreby upravená medzi 0,1 a 1,0 μmol/l.
b) Koncentrácia templátu: Ak je templátom neriedený zásobný roztok cDNA, použitý objem by nemal presiahnuť 1/10 celkového objemu reakcie qPCR.
c) Riedenie šablóny: Odporúča sa zriediť zásobný roztok cDNA 5-10 krát.Optimálne množstvo pridaného templátu je lepšie, keď je hodnota Ct získaná amplifikáciou 20-30 cyklov.
d) Reakčný systém: Na zabezpečenie účinnosti a opakovateľnosti amplifikácie cieľového génu sa odporúča použiť 20 μl alebo 50 μl.
e) Príprava systému: Pripravte sa na super čistom stole a použite hroty a reakčné skúmavky bez zvyškov nukleázy;odporúča sa používať hroty s filtračnými vložkami.Zabráňte krížovej kontaminácii a aerosólovej kontaminácii.
2.Program reakcie
Štandardný program
| Krok cyklu | tepl. | čas | Cykly |
| Počiatočná denaturácia | 95 ℃ | 2 min | 1 |
| Denaturácia | 95 ℃ | 10 sek | 40 |
| Žíhanie/Predlžovanie | 60 ℃ | 30 sekúnd★ | |
| Štádium krivky topenia | Predvolené nastavenia prístroja | 1 | |
Rýchly program
| Krok cyklu | tepl. | čas | Cykly |
| Počiatočná denaturácia | 95 ℃ | 30 sek | 1 |
| Denaturácia | 95 ℃ | 3 sek | 40 |
| Žíhanie/Predlžovanie | 60 ℃ | 20 sekúnd★ | |
| Štádium krivky topenia | Predvolené nastavenia prístroja | 1 | |
[Poznámka]: Rýchly program je vhodný pre veľkú väčšinu génov a štandardné programy možno vyskúšať pre jednotlivé komplexné gény sekundárnej štruktúry.
a) Teplota a čas žíhania: Upravte podľa dĺžky priméru a cieľového génu.
b) Získanie fluorescenčného signálu (★): Nastavte experimentálny postup podľa požiadaviek v návode na použitie prístroja.
c) Krivka topenia: Predvolený program prístroja možno použiť normálne.
3. Analýza výsledkov
Na kvantitatívne experimenty boli potrebné minimálne tri biologické replikáty.Po reakcii je potrebné potvrdiť krivku amplifikácie a krivku topenia.
3.1 Krivka zosilnenia:
Štandardná krivka amplifikácie má tvar S.Kvantitatívna analýza je najpresnejšia, keď hodnota Ct klesne medzi 20 a 30. Ak je hodnota Ct nižšia ako 10, je potrebné šablónu zriediť a vykonať test znova.Keď je hodnota Ct medzi 30-35, je potrebné zvýšiť koncentráciu templátu alebo objem reakčného systému, aby sa zlepšila účinnosť amplifikácie a zabezpečila presnosť analýzy výsledkov.Keď je hodnota Ct väčšia ako 35, výsledky testu nemôžu kvantitatívne analyzovať expresiu génu, ale môžu sa použiť na kvalitatívnu analýzu.
3.2 Krivka topenia:
Jediný vrchol krivky topenia ukazuje, že špecificita reakcie je dobrá a je možné vykonať kvantitatívnu analýzu;ak krivka topenia vykazuje dvojité alebo viacnásobné píky, nie je možné vykonať kvantitatívnu analýzu.Krivka topenia ukazuje dvojité píky a je potrebné posúdiť, či necieľový pík je primérový dimér alebo nešpecifická amplifikácia pomocou DNA agarózovej gélovej elektroforézy.Ak ide o dimér priméru, odporúča sa znížiť koncentráciu primérov alebo prepracovať priméry s vysokou účinnosťou amplifikácie.Ak ide o nešpecifickú amplifikáciu, zvýšte teplotu žíhania alebo upravte priméry so špecifickosťou.
Poznámky
Noste potrebné OOP, ako je laboratórny plášť a rukavice, aby ste zaistili svoje zdravie a bezpečnosť！
Tento produkt je určený LEN na výskumné účely!
