Plant direct PCR Kit

Kat. číslo: HCR2020A

Plant Direct PCR Kit je vhodný na priamu amplifikáciu listov rastlín, semien atď. a možno ho použiť na vysoko výkonný skríning vzoriek rastlín, ktoré neobsahujú polysacharidy a polyfenoly.Priama amplifikačná DNA polymeráza založená na riadenej evolúcii má vynikajúcu toleranciu voči inhibítorom PCR v rastlinách.Medzitým si zachováva vysoký výkon amplifikácie, ktorý je vhodný na amplifikáciu fragmentov DNA do 5 kb.Jedinečný lyzačný pufor A v súprave možno použiť na lýzu čerstvých alebo zmrazených rastlinných tkanív.Je ľahko ovládateľný a lyzát možno použiť ako templát na amplifikáciu bez čistenia.Systém obsahuje ochranné činidlá, ktoré umožňujú efektívne zosilnenie surových vzoriek po opakovanom zmrazovaní a rozmrazovaní.2 × Plant Direct Master Mix potrebuje na vykonanie amplifikačnej reakcie iba pridať priméry a šablóny, čím sa zníži počet pipetovacích operácií a zlepší sa priepustnosť detekcie a reprodukovateľnosť výsledkov.

Komponenty

*Plant Direct Lysis Buffer B je voliteľné činidlo, ktoré sa používa na neutralizáciu Plant Direct Lysis Buffer A na predĺženie doby skladovania vzoriek.Môže byť použitý podľa skutočnej situácie.

Podmienky skladovania

2 × Plant Direct Master Mix, skladujte pri -30 ~ -15 ℃ a vyhnite sa opakovanému zmrazovaniu a rozmrazovaniu;Zasaďte tlmivý roztok na priamu lýzu, skladujte pri -30 ~ -15 ℃ alebo 2 ~ 8 ℃.

Experimentálny proces

Spracovanie vzorky–List rastliny

Priama metóda:Odporúča sa použiť mladé listy.Na získanie malej a rovnomernej vzorky použite dierovač s pevným priemerom 0,5 – 3 mm a potom vzorku pridajte priamo do systému PCR (odporúča sa 50 μl systém).Ubezpečte sa, že vzorka je v roztoku PCR a nie pri stene skúmavky.Ak sa na amplifikáciu dlhých fragmentov a komplexných vzoriek používa priama PCR, použitie vzorky s menším priemerom (0,5 – 1 mm) ako šablóny môže pomôcť dosiahnuť lepšie výsledky.

Metóda lýzy mletia:Odporúča sa použiť mladé listy.Vezmite malý kúsok listu (približne 1 – 3 mm v priemere), vložte ho do 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab a rozdrvte ho čo najviac (tento krok je možné vykonať stlačením listu špičkou 100 μl pipety rozdrviť vzorku).Ak sa použijú väčšie objemy pletiva listov (nepresahujú 7 mm), zvýšte objem riediaceho pufra na 50 μl.Po pomletí listov by mal byť roztok zelený.Po krátkej centrifugácii pridajte 1 μl supernatantu do systému PCR ako reakčný templátc .

Metóda tepelnej lýzy:Odporúča sa použiť mladé listy.Vezmite malý kúsok listu (približne 1 – 3 mm v priemere), vložte ho do 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A a zohrejte ho na 95 °C počas 5 – 10 minút.Čas lýzy možno primerane predĺžiť v prípade listov, ktoré sa ťažko lyzujú (nie viac ako 20 minút).Ak sa použijú väčšie objemy pletiva listov (nepresahujú 7 mm), zvýšte objem riediaceho pufra na 50 μl.Po zahriatí krátko odstred'ujte a pridajte 1 μl supernatantu do systému PCR ako reakčnú šablónub.

Spracovanie vzorky– Semená rastlín

Metóda lýzy mletia:Skalpelom narežte semená s priemerom 5 mm, pridajte ich do 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A a vzorku rozdrvte špičkou pipety alebo inými nástrojmi.Krátko vortexujte a nechajte 3 – 5 minút postáť pri izbovej teplote.Uistite sa, že vzorka semien je ponorená v riediacom pufri.Po krátkej centrifugácii pridajte 1 μl supernatantu do systému PCR ako reakčnú šablónu.

Metóda tepelnej lýzy:Skalpelom narežte semená s priemerom 5 mm, pridajte ich do 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A a zohrejte na 95 °C 5 – 10 min.Čas lýzy môže byť primerane predĺžený pre listy, ktoré sa ťažko lyzujú (nie viac ako 30 minút).Po zahriatí krátko odstred'ujte a pridajte 1 μl supernatantu do systému PCR ako reakčnú šablónub.

a.Na rezanie vzoriek vhodnej veľkosti je možné použiť aj nožnice alebo iné nástroje;ak sa razník alebo nožnice znovu použijú, mali by sa pred každým použitím vyčistiť 2 % roztokom chlórnanu sodného, ​​aby sa zabránilo krížovej kontaminácii medzi vzorkami.

b.Pred použitím sa uistite, že je Plant Direct Lysis Buffer úplne rozpustený.Ak je pufor viskózny alebo obsahuje zrazeniny, môže sa pred použitím zahriať na 37 °C, aby sa úplne roztopil.

c.Objem templátu v reakčnom systéme možno vhodne upraviť podľa rozdielu v objeme rastlinného materiálu a pridaného riedidla.

Pufér na priamu lýzu rastlín

Plant Direct Lysis Buffer A obsiahnutý v tomto produkte bol prísne optimalizovaný na uvoľnenie genómu väčšiny rastlinných tkanív a je vhodný na krátkodobé skladovanie surových rastlín pri 4 °C.Ak je potrebné vzorku skladovať dlhší čas (napr. 1 – 2 mesiace), odporúča sa preniesť supernatant do novej EP skúmavky a skladovať pri teplote -20 °C.Pre stabilnejšie skladovanie vzoriek pridajte rovnaký objem Plant Direct Lysis Buffer B do preneseného supernatantu, dobre premiešajte a skladujte pri -20 °C.Stabilný čas skladovania sa líši v závislosti od vzoriek a stavov rastlín.

Reakčný systém

a.Obsahuje Mg²⁺pri konečnej koncentrácii 2 mM.

b.Odporúča sa použiť konečnú koncentráciu 0,4 μM pre každý primer.Nadmerné používanie primérov povedie k zvýšenej nešpecifickej amplifikácii.

c.Množstvo použitej vzorky je možné upraviť podľa aktuálnej situácie.Množstvo použité v jednej reakcii surovej lyzovanej vzorky je možné upraviť medzi 2 % – 20 % z celkového objemu reakcie.Použitie príliš veľkého množstva vzoriek môže spôsobiť zlyhanie zosilnenia.

Program reakcie

a.Počiatočná denaturácia (98 °C, 5 minút) podporuje lýzu rastlinného tkaniva, pričom sa uvoľňuje genómová DNA, ktorú možno použiť na amplifikáciu PCR.Neskracujte čas ani neznižujte teplotu.

b.Odporúča sa nastaviť ju na rovnakú hodnotu Tm základného náteru alebo o 2 ~ 4 °C vyššiu ako je hodnota Tm.Priama amplifikačná DNA polymeráza použitá v tomto produkte sa líši od konvenčnej Taq DNA polymerázy a má špeciálne požiadavky na reakčnú teplotu žíhania; použitie vysokej teploty žíhania môže účinne znížiť nešpecifickú amplifikáciu a zlepšiť účinnosť amplifikácie.V prípade zložitých šablón možno efektívnu amplifikáciu dosiahnuť úpravou teploty žíhania a predĺžením času predĺženia.

c.Ak je dĺžka amplifikačného produktu ≤ 1 kb, čas predĺženia sa nastaví na 30 sekúnd/kb;ak je dĺžka amplifikačného produktu >1 kb, čas predĺženia je nastavený na 60 sekúnd/kb.

d.Pre komplexné vzorky alebo vzorky s nízkym výťažkom amplifikácie je možné počet cyklov primerane zvýšiť na 40 - 50 cyklov.

Aplikácie

Je použiteľný na priamu amplifikáciu rastlinných pletív a vysokovýkonný skríning rastlinných vzoriek, ktoré neobsahujú polysacharidy a polyfenoly.

Poznámky

Len na výskumné použitie.Nepoužívať pri diagnostických postupoch.

1. Pre hrubú rastlinnú amplifikáciu alebo priamu amplifikáciu sa odporúča použiť purifikovanú genómovú DNA ako pozitívnu kontrolu pred začatím experimentu, aby sa zabezpečilo, že systém, priméry a operácie sú správne.

2. Priama amplifikačná DNA polymeráza použitá v tejto súprave má silnú korektúrnu aktivitu.Ak je potrebné vykonať klonovanie TA, odporúča sa pred pridaním adenínu purifikovať DNA.

3. Pokyny pre návrh základného náteru:

a.Odporúča sa, aby posledná báza na 3′ konci základného náteru bola G alebo C.

b.Malo by sa zabrániť následným nezhodám v posledných 8 bázach na 3′ konci priméru.c.Vyhnite sa vlásenkovým štruktúram na 3′ konci základného náteru.

d.Rozdiely v hodnote Tm dopredného primeru a reverzného primeru by nemali byť väčšie ako 1 °C a hodnota Tm by mala byť upravená na 60 ~ 72 °C (na výpočet hodnoty Tm sa odporúča Primer Premier 5).

e.Dodatočné sekvencie primérov, ktoré sa nezhodujú s templátom, by nemali byť zahrnuté pri výpočte hodnoty Tm priméru.

f.Odporúča sa, aby obsah GC základného náteru bol 40% -60%.

g.Celková distribúcia A, G, C a T v primeru by mala byť čo najrovnomernejšia.Vyhnite sa používaniu oblastí s vysokým obsahom GC alebo AT.

h.Vyhnite sa prítomnosti komplementárnych sekvencií s 5 alebo viacerými bázami buď v priméri alebo medzi dvoma primérmi a vyhnite sa prítomnosti komplementárnych sekvencií s 3 alebo viacerými bázami na 3' konci dvoch primérov.

i.Použite funkciu NCBI BLAST na kontrolu špecifickosti priméru, aby ste zabránili nešpecifickej amplifikácii.