Hotstart Taq DNA polymeráza
Hot Start Taq DNA Polymerase (modifikácia protilátky) je termostabilná DNA polymeráza s horúcim štartom od spoločnosti Thermus aquaticus YT-1, ktorá má 5′→3′ polymerázovú aktivitu a 5′ klapkovú endonukleázovú aktivitu.Hot-start Taq DNA polymeráza je Taq DNA polymeráza, ktorá je modifikovaná termolabilnými Taq protilátkami.Modifikácia protilátky zvýšila špecifickosť, citlivosť a výťažok PCR.
Komponenty
| Komponent | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq Buffer | 4 x 1 ml | 4 x 10 ml | 4 x 50 ml | 5 x 400 ml |
| Hot Start Taq DNA polymeráza (upravená protilátka) (5 U/μl) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 10 x 5 ml |
Aplikácie
10 mM Tris-HCl (pH 7,4 pri 25 °C), 100 mM KCI, 0,1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol, 0,5 % Tween20, 0,5 % IGEPALCA-630 a 50 % glycerol.
Skladovací stav
Prepravujte pri teplote 0°C a skladujte pri teplote -25°C~-15°C.
Definícia jednotky
Jedna jednotka je definovaná ako množstvo enzýmu, ktoré inkorporuje 15 nmol dNTP do materiálu nerozpustného v kyseline za 30 minút pri 75 °C.
Kontrola kvality
1.Endnukleázová aktivita:Inkubácia 20 U enzýmu so 4 ug pUC19 DNA počas 4 hodín pri 37 °C neviedla k žiadnej detegovateľnej degradácii DNA, ako bolo stanovené gélovou elektroforézou.
2.5 kb Lambda PCR:25 cyklov PCR amplifikácie 5 ng Lambda DNA s 1,25 jednotkami Taq DNA polymerázy v prítomnosti 200 uM dNTP a 0,2 uM primérov vedie k očakávanému 5 kb produktu.
3.Exonukleázová aktivita:Inkubácia 50 µl reakcie obsahujúcej minimálne 12,5 U Taq DNA polymerázy s 10 nmol 5´-FAM oligonukleotidu počas 30 minút pri 37 °C nevedie k žiadnej detegovateľnej degradácii.
4.RNázová aktivita:Inkubácia 10 ul reakcie obsahujúcej 20 U enzýmu s 1 ug RNA transkriptov počas 2 hodín pri 37 °C neviedla k žiadnej detegovateľnej degradácii RNA, ako sa stanovilo gélovou elektroforézou.
5.Tepelná inaktivácia:Nie
Reakčný systém
| Komponenty | Objem |
| DNA šablónya | voliteľné |
| 10 μM Forward Primer | 0,5 μl |
| 10 μM reverzný základný náter | 0,5 μl |
| dNTP Mix (10 mM každý) | 0,5 μl |
| 5×HC Taq Buffer | 5 μl |
| Taq DNA polymerázab(5U/μL) | 0,125 μl |
| Voda bez nukleázy | Až 25 μl |
Poznámky:
1) a.
| DNA | Suma |
| Genomický | 1 ng-1 μg |
| Plazmidové alebo vírusové | 1 pg-1 ng |
2) b.Optimálna koncentrácia Taq DNA polymerázy sa môže v špecializovaných aplikáciách pohybovať v rozmedzí 5-50 jednotiek/ml (0,1-0,5 jednotiek/25 µl reakcie).
Protokol tepelného cyklovania
PCR
| Krok | Teplota(°C) | čas | Cykly |
| Počiatočná denaturáciaa | 95 ℃ | 1-3 min | - |
| Denaturácia | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 cyklov |
| Žíhanieb | 45-68 ℃ | 15-60 s | |
| Rozšírenie | 68 ℃ | 1 kb/min | |
| Záverečné predĺženie | 68 ℃ | 5 min | - |
Poznámky:
1) Počiatočná denaturácia 1 minúta pri 95 °C je dostatočná pre väčšinu amplifikácií.Pre zložité šablóny sa odporúča dlhšia denaturácia 2-3 minúty pri 95°C.Pri PCR kolónií sa odporúča počiatočná 5-minútová denaturácia pri 95 °C.
2) Krok žíhania je typicky 15-60 s.Teplota žíhania je založená na Tm páru primérov a je typicky 45-68 °C.
