Uracilová DNA glykozyláza
Uracil-DNA glykozyláza (UNG alebo UDG) je rekombinantný klon E. coli s molekulovou hmotnosťou 25 kDa.Katalyzuje uvoľňovanie voľného uracilu z jednovláknovej a dvojvláknovej DNA obsahujúcej uracil a je neaktívny proti RNA a možno ho použiť na zabránenie kontaminácii produktov amplifikácie PCR.Princíp účinku je založený na skutočnosti, že ak sa dUTP v PCR reakcii nahradí dTTP a vznikne PCR amplifikačný produkt obsahujúci bázy dU, enzým dokáže selektívne rozbiť glykozidickú väzbu U báz v jednovláknovej a dvojvláknovej DNA a degradovať produkt amplifikácie PCR.
Odporúčaná aplikácia
Zosilnenie prevencie kontaminácie
Skladovací stav
-20°C na dlhodobé skladovanie, pred použitím treba dobre premiešať, vyhýbať sa častému zmrazovaniu a rozmrazovaniu.
Vyrovnávacia pamäť
20 mM Tris-HCI (pH 8,0), 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, stabilizátor, 50 % glycerol.
Definícia jednotky
Množstvo enzýmu potrebného na degradáciu 1 ug jednovláknovej DNA obsahujúcej dU bázy za 1 hodinu pri 37 °C je 1 jednotka.
Kontrola kvality
1.SDS-PAGE elektroforetická čistota vyššia ako 98 %
2.Citlivosť zosilnenia, kontrola medzi dávkami, stabilita
3.Po ošetrení 1U UNG pri teplote 50 °C počas 2 minút by mala byť šablóna obsahujúca U pod 103 kópií úplne degradovaná a nie je možné vyrobiť žiadny amplifikačný produkt.
4.Žiadna exogénna nukleázová aktivita
Inštrukcie
| Komponenty | Objem (μl) | Záverečné sústredenie |
| 10 x PCR pufer (bez dNTP, Mg2+zadarmo) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 uM |
| dUTP (nahradiť dTTP) | - | 200-600 uM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 ul | 1-4 mM |
| 5 U/μl Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1 – 0,5) |
| 25 × Primer Mixa | 2 | 1× |
| Šablóna | - | ＜1 μg/reakcia |
| ddH20 | Do 50 | - |
Poznámka: a: Ak sa používa pre qPCR/qRT-PCR, fluorescenčná sonda by sa mala pridať do reakčného systému.Zvyčajne môže poskytnúť dobré výsledky konečná koncentrácia primeru 0,2 μM;keď je reakčný výkon slabý, koncentrácia priméru môže byť nastavená v rozsahu 0,2-1 uM.Zvyčajne je koncentrácia sondy optimalizovaná v rozsahu 0,1-0,3 μM.Na nájdenie najlepšej kombinácie priméru a sondy možno vykonať experimenty s koncentračným gradientom.
Poznámky
1.Enzým UNG možno použiť na odstránenie kontaminovaných produktov amplifikácie dUTP z reakčného systému pred amplifikačnou reakciou PCR, aby sa predišlo falošne pozitívnym výsledkom v dôsledku kontaminácie produktu.
2.Optimálna teplota pre UNG enzým, ktorý sa má použiť v anti-kontaminačnej PCR reakcii, je všeobecne 50 °C počas 2 minút;podmienka deaktivácie je 95 °C po dobu 5 minút.
3.Vyhýbajte sa častému zmrazovaniu a rozmrazovaniu a nevystavujte veľkým teplotným výkyvom.
4.Rôzne gény, ktoré sa majú amplifikovať, majú rôznu účinnosť využitia dUTP a citlivosť na enzým UNG, preto ak použitie systému UNG vedie k zníženiu citlivosti detekcie, reakčný systém by sa mal upraviť a optimalizovať, ak potrebujete technickú podporu, kontaktujte naša spoločnosť.
