Proteináza K NGS (prášok)

Špecifikácia

Vlastnosti

Definícia jednotky

Jedna jednotka NGS proteázy K je definovaná ako množstvo enzýmu potrebného na hydrolýzu kazeínu na 1 μmol L-tyrozínu za štandardných podmienok stanovenia.

 Príprava činidiel

Činidlo I:

Substrát: 1 % kazeín z roztoku hovädzieho mlieka: 1 g kazeínu z hovädzieho mlieka rozpustite v 50 ml 0,1 M roztoku fosforečnanu sodného, ​​pH 8,0, zahrievajte vo vodnom kúpeli pri 65-70 °C počas 15 minút, premiešajte a rozpustite, ochlaďte vodou, upravte o hydroxid sodný na pH 8,0 a zriedi sa na 100 ml.

Činidlo II:

Roztok TCA: 0,1 M kyselina trichlóroctová, 0,2 M octan sodný a 0,3 M kyselina octová (navážte postupne 1,64 g kyseliny trichlóroctovej + 1,64 g octanu sodného + 1,724 ml kyseliny octovej, pridajte 50 ml deionizovanej vody, upravte pomocou HCl na pH 4,03 a zriedte 100 ml).

Činidlo III:

0,4 m roztoku uhličitanu sodného (navážte 4,24 g bezvodého uhličitanu sodného a rozpustite v 100 ml vody)

Činidlo IV:

Folínové fenolové činidlo: zrieďte 5-krát deionizovanou vodou.

Činidlo V:

Enzýmové riedidlo: 0,1 M roztok fosforečnanu sodného, ​​pH 8,0.

Činidlo VI:

Štandardný roztok L-tyrozínu: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tyrozínu rozpusteného s 0,2 M HCl.

Postup

1. Zapnite UV-Vis spektrofotometer a vyberte fotometrické meranie.

2. Nastavte vlnovú dĺžku na 660 nm.

3. Zapnite vodný kúpeľ, nastavte teplotu na 37 °C, zaistite nezmenenú teplotu po dobu 3-5 minút.

4. Predhrievajte 0,5 ml substrátu v 2 ml centrifugačnej skúmavke pri 37 °C vodnom kúpeli počas 10 minút.

5. Extrahujte 0,5 ml zriedeného roztoku enzýmu do predhriatej centrifugačnej skúmavky počas 10 minút.Nastavte riedidlo enzýmu ako prázdnu skupinu.

6. Ihneď po reakcii pridajte 1,0 ml činidla TCA.Dobre premiešajte a inkubujte vo vodnom kúpeli 30 minút.