Proteináza K (tekutá)
Kat. č.: HC4502A
Proteináza K je stabilná serínová proteáza so širokou substrátovou špecifickosťou.Odbúrava mnohé bielkoviny v natívnom stave aj v prítomnosti detergentov.Dôkazy zo štúdií kryštálovej a molekulárnej štruktúry naznačujú, že enzým patrí do rodiny subtilizínov s katalytickou triádou aktívneho miesta (Asp39-Jeho69- Ser224).Prevládajúcim miestom štiepenia je peptidová väzba susediaca s karboxylovou skupinou alifatických a aromatických aminokyselín s blokovanými alfa-aminoskupinami.Bežne sa používa pre svoju šírkušpecifickosť.
Špecifikácia
| Vzhľad | Bezfarebná až svetlohnedá kvapalina |
| Aktivita | ≥800 U/ml |
| Koncentrácia bielkovín | ≥20 mg/ml |
| DNase | Žiadne zistené |
| RNáza | Žiadne zistené |
Podmienky skladovania
Skladujte pri teplote 2-8 ℃.
Vlastnosti
| EC číslo | 3.4.21.64 (Rekombinant z albumu Tritirachium) |
| Molekulová hmotnosť | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Izoelektrický bod | 7,81 |
| Optimálne pH | 7,0-12,0 Obr.1 |
| Optimálna teplota | 65 ℃ Obr.2 |
| pH stabilita | pH 4,5-12,5 (25℃, 16 h) Obr.3 |
| Tepelná stabilita | Pod 50℃ (pH 8,0, 30 minút) Obr.4 |
| Aktivátory | KBÚ, močovina |
| Inhibítory | diizopropylfluórfosfát;fenylmetylsulfonylfluorid |
Aplikácie
1. Genetická diagnostická súprava
2. Súpravy na extrakciu RNA a DNA
3. Extrakcia neproteínových zložiek z tkanív, degradácia proteínových nečistôt, ako sú DNA vakcíny a príprava heparínu
4. Príprava chromozómovej DNA pulznou elektroforézou
5. Western blot
6. In vitro diagnostika enzymatických glykozylovaných albumínov
Prevencia
Pri používaní alebo vážení noste ochranné rukavice a okuliare a po použití dobre vetrajte.Tento produkt môže spôsobiť kožnú alergickú reakciu a vážne podráždenie očí.Pri vdýchnutí môže spôsobiť príznaky alergie alebo astmy alebo dýchavičnosť.Môže spôsobiť podráždenie dýchacích ciest.
Skúška
Definícia jednotky
Jedna jednotka (U) je definovaná ako množstvo enzýmu potrebného na hydrolýzu kazeínu na produkciu 1 μmol tyrozínu za minútu za nasledujúcich podmienok.
Príprava činidiel
Činidlo I: 1 g mliečneho kazeínu sa rozpustil v 50 ml 0,1 M roztoku fosforečnanu sodného (pH 8,0), inkuboval sa v 65-70 °C vody počas 15 minút, miešal sa a rozpustil, ochladil sa vodou, pH sa upravilo hydroxidom sodným na 8,0 a fixovalo sa objem 100ml.
Činidlo II: roztok TCA: 0,1 M kyselina trichlóroctová, 0,2 M octan sodný, 0,3 M kyselina octová.
Činidlo III: 0,4M Na2CO3Riešenie.
Činidlo IV: Činidlo Forint riedené čistou vodou 5-krát.
Činidlo V: Enzýmové riedidlo: 0,1 M roztok fosforečnanu sodného (pH 8,0).
Činidlo VI: Tyrozínový roztok: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tyrozínu rozpustený s 0,2 M HCl.
Postup
1. 0,5 ml činidla I sa predhreje na 37 °C, pridá sa 0,5 ml roztoku enzýmu, dobre sa premieša a inkubuje sa 10 minút pri 37 °C.
2. Na zastavenie reakcie pridajte 1 ml činidla II, dobre premiešajte a pokračujte v inkubácii 30 minút.
3. Odstreďte reakčný roztok.
4. Vezmite 0,5 ml supernatantu, pridajte 2,5 ml činidla III, 0,5 ml činidla IV, dobre premiešajte a inkubujte pri 37 °C 30 minút.
5. OD660bola určená ako OD1;slepá kontrolná skupina: 0,5 ml činidla V sa použije na nahradenie roztoku enzýmu na stanovenie OD660ako OD2, AOD=OD1-OD2.
6. Štandardná krivka L-tyrozínu: 0,5 ml roztoku L-tyrozínu rôznej koncentrácie, 2,5 ml činidla III, 0,5 ml činidla IV v 5 ml centrifugačnej skúmavke, inkubovať pri 37 °C počas 30 minút, detekovať OD660pre rôzne koncentrácie L-tyrozínu sa potom získa štandardná krivka Y=kX+b, kde Y je koncentrácia L-tyrozínu, X je OD600.
Kalkulácia
2: Celkový objem reakčného roztoku (ml)
0,5: Objem roztoku enzýmu (ml)
0,5: Objem reakčnej kvapaliny použitý pri chromogénnom stanovení (ml)
10: Reakčný čas (min)
Df: Viacnásobné riedenie
C: Koncentrácia enzýmu (mg/ml)
Referencie
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.komun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.a spol.,Eur.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet spol., Molecular Cloning: A Laboratory Manuál, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Figúrky
Obr. 1 Optimálne pH
100 mM tlmivý roztok: pH 6,0-8,0, fosforečnan sodný;pH 8,0 - 9,0, Tris-HCl;pH 9,0-12,5, glycín-NaOH. Koncentrácia enzýmu: 1 mg/ml
Obr. 2 Optimálna teplota
Reakcia v 20 mM K-fosfátovom pufri pH 8,0.Koncentrácia enzýmu: 1 mg/ml
Obr. 3 pH Stabilita
25 °C, 16 h-ošetrenie 50 mM tlmivým roztokom: pH 4,5-5,5, acetát;pH 6,0-8,0, fosforečnan sodný;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, glycín-NaOH.Koncentrácia enzýmu: 1 mg/ml
Obr. 4 Tepelné stabilitu
30 minútové ošetrenie s 50 mM Tris-HCl pufrom, pH 8,0.Koncentrácia enzýmu: 1 mg/ml
Obr. 5 Skladovanie stabilizovaťty at 25 ℃
