M-MLV reverzná transkriptáza
RevScript Reverzná transkriptáza sa získava technológiou genetického inžinierstva.Má vyššiu schopnosť syntézy cDNA, tepelnú stabilitu a limit reakčnej teploty (do 60°C).Syntetizovaný produkt cDNA má veľkosť až 10 kb.Zvyšuje afinitu templátov a je vhodný na reverznú transkripciu RNA templátov s komplexnou sekundárnou štruktúrou alebo génmi s nízkym počtom kópií.
Komponenty
| Komponent | HC2003B (10 000 U) | HC2003B (5*10 000 U) | HC2003B (200 000 U) |
| RevScript reverzná transkriptáza (200 U/μL) | 50 ul | 5 x 50 μl | 1 ml |
| 5 × vyrovnávacia pamäť RevScript | 250 ul | 1,25 ml | 5 ml |
Skladovací stav
Tento produkt by sa mal skladovať pri teplote -25°C~-15°C po dobu 2 rokov.
Definícia jednotky
Jedna jednotka začlení 1 nmol dTTP do materiálu nerozpustného v kyseline za 10 minút pri 37 °C s použitím Oligo(dT) ako primerov.
Nastavenie reakcie
1.Denaturácia templátu RNA (Tento krok je voliteľný, denaturácia templátu RNA pomáha otvoriť sekundárne štruktúry, čo zlepší výťažok prvého vlákna cDNA.)
| Komponenty | Hlasitosť (μL) |
| ddH bez RNázy2O | Do 13 |
| oligo(dT)18 (50 μmol/l) alebo Random Primer (50 μmol/l) Alebo génovo špecifické priméry (2 μmol/l) | 1 |
| alebo 1 | |
| alebo 1 | |
| RNA templát | X a |
Poznámky:
1) a: Celková RNA: 1-5 ug alebo mRNA: 1-500 ng
2) Inkubácia pri teplote 65 °C počas 5 minút, potom premiestnenie na ľad ihneď na 2 minúty schladenie.Krátke odstreďovanie na zber reakčnej kvapaliny, pridajte reakčný roztok pre reverznú transkripciu, ako je uvedené v nasledujúcej tabuľke.Jemne pipetou premiešajte.
1.Príprava reakčnej zmesi (objem 20 μl)
| Komponenty | Hlasitosť (μL) |
| Zmes predchádzajúceho kroku | 13 |
| 5 × vyrovnávacia pamäť | 4 |
| Zmes dNTP (10 nmol/l) | 1 |
| Reverzná transkriptáza (200 U/μl) | 1 |
| Inhibítor RNázy (40 U/μl) | 1 |
1.Vykonajte reakciu za nasledujúcich podmienok:
| Teplota (°C) | čas |
| 25 °Ca | 5 min |
| 42 °Cb | 15-30 min |
| 85 °Cc | 5 min |
Poznámky:
1) a.Inkubácia pri 25 °C počas 5 minút je potrebná len na použitie náhodných hexamérov.Pri používaní Oligo (dT) preskočte tento krok18alebo Gene Specific Primer.
2) b.Odporúčaná teplota reverznej transkripcie je 42°C. Pre templáty s komplikovanými sekundárnymi štruktúrami alebo vysokým obsahom GC sa odporúča zvýšiť reakčnú teplotu na 50-55°C.
3) c.Zahrievanie na 85 °C počas 5 minút na inaktiváciu reverznej transkriptázy.
4) Produkt sa môže priamo použiť v reakciách PCR alebo qPCR alebo sa môže krátkodobo skladovať pri teplote -20 °C.Pre dlhodobé skladovanie sa odporúča produkty zarovnať a skladovať pri -80°C.Vyhnite sa častému zmrazovaniu a rozmrazovaniu.
5) Produkt je vhodný pre jednokrokovú RT-qPCR, odporúča sa pridať 10-20 U reverznej transkriptázy na každých 25μL reakčného systému, alebo postupne zvyšovať množstvo reverznej transkriptázy podľa aktuálnej situácie.
Poznámky
1.Udržujte experimentálnu oblasť čistú;Počas prevádzky by ste mali nosiť čisté rukavice a masky.Všetok spotrebný materiál použitý v experimente by mal byť bez RNázy, aby sa zabránilo kontaminácii RNázou.
2.Všetky postupy by sa mali vykonávať na ľade, aby sa zabránilo degradácii RNA.
3.Na zabezpečenie vysokej účinnosti reverznej transkripcie sa odporúčajú vysokokvalitné vzorky RNA.
4.Tento produkt je určený len na výskumné účely.
5.Pre svoju bezpečnosť používajte laboratórne plášte a jednorazové rukavice.
