RTL reverzná transkriptáza
RTL reverzná transkriptáza je DNA polymeráza závislá od templátu RNA, ktorej chýba 3'→5' exonukleázová aktivita a má aktivitu RNázy H.Tento enzým môže použiť RNA ako templát na syntézu komplementárneho vlákna DNA, ktoré možno použiť na syntézu prvého vlákna cDNA, najmä pre RT-LAMP (loop-mediated isothermal amplification).V porovnaní s RTL reverznou transkriptázou 1.0 je citlivosť výrazne zlepšená, tepelná stabilita je silnejšia a reakcia pri 65 °C je stabilnejšia.RTL reverzná transkriptáza (bez glycerolu) sa môže použiť na prípravu lyofilizovaných prípravkov, lyofilizovaných RT-LAMP činidiel atď.
Definícia jednotky
Jedna jednotka začlení 1 nmol dTTP do materiálu vyzrážateľného kyselinou za 20 minút pri 50 °C s použitím poly(A)•oligo(dT)25 ako templátového primeru.
Komponenty
| Komponent | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL reverzná transkriptáza (bez glycerolu) (15 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL vyrovnávacia pamäť | 1,5 ml | 4 x 1,5 ml | 5 x 10 ml |
| MgS04 (100 mM) | 1,5 ml | 2 x 1,5 ml | 3 x 10 ml |
Skladovací stav
Prepravujte pri teplote 0°C a skladujte pri teplote -25°C~-15°C.
Kontrola kvality
- Zvyšková aktivitaEndonukleáza:Reakcia s objemom 50 ul obsahujúca 1 ug λDNA a 15 jednotiek RTL2.0 inkubovaná počas 16 hodín pri 37 °C vykazuje rovnaký profil ako negatívna kontrola pomocou gélovej elektroforézy.
- Zvyšková aktivitaExonukleáza:Reakcia s objemom 50 ul obsahujúca 1 ug λDNA štiepenej HindⅢ a 15 jednotiek RTL2.0 inkubovaných počas 16 hodín pri 37 °C vykazuje rovnaký profil ako negatívna kontrola pomocou gélovej elektroforézy.
- Zvyšková aktivitaNickase:Reakcia s objemom 50 ul obsahujúca 1 ug superšpirálneho pBR322 a 15 jednotiek RTL2.0 inkubovaných počas 4 hodín pri 37 °C vykazuje rovnaký profil ako negatívna kontrola pomocou gélovej elektroforézy.
- Zvyšková aktivitaRNáza:Reakcia s objemom 10 ul obsahujúca 0,48 ug MS2 RNA a 15 jednotiek RTL2.0 inkubovaná počas 4 hodín pri 37 °C vykazuje rovnaký vzor ako negatívna kontrola pomocou gélovej elektroforézy.
- E. coli gDNA:Merané sE.colišpecifické súpravy na detekciu HCD, 15 jednotiek RTL2.0 obsahuje menej ako 1E. coligenóm.
Nastavenie reakcie
Protokol syntézy cDNA
| Komponenty | Objem |
| Templátová RNA a | voliteľné |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) alebo Random Primer mix (60uM) | 2 μl |
| dNTP Mix (10 mM každý) | 1 μl |
| Inhibítor RNázy (40 U/ul) | 0,5 μl |
| RTL reverzná transkriptáza 2.0 (15U/ul) | 0,5 μl |
| 10×HC RTL vyrovnávacia pamäť | 2 μl |
| Voda bez nukleázy | Až 20 μl |
Poznámky:
1) Odporúčaná dávka celkovej RNA je 1ng~1μg
2) Odporúčaná dávka mRNA bola 50 ng~100 ng
Thermo-bicyklovanie Podmienky pre rutinu reakcia:
| Teplota (°C) | čas |
| 25 °Ca | 5 min |
| 55 °C | 10 minb |
| 80 °C | 10 min |
Poznámky:
1) Ak sa použije Random Primer Mix, inkubačný krok pri 25 °C.
2) Ak sa použije cieľová zmes primérov, krok inkubácie pri 55 °C počas 10 až 30 minút.
Protokol RT-LAMP
| Komponenty | Objem | Konečná koncentrácia |
| Šablóna RNA | voliteľné | ≥10 kópií |
| dNTP Mix (10 mM) | 3,5 μl | 1,4 mM |
| Primery FIP/BIP (25×) | 1 μl | 1,6 uM |
| Základné nátery F3/B3 (25×) | 1 μl | 0,2 μM |
| Priméry LoopF/LoopB (25×) | 1 μl | 0,4 uM |
| Inhibítor RNázy (40 U/μl) | 0,5 μl | 20 U/reakcia |
| RTL reverzná transkriptáza 2.0 (15 U/μL) | 0,5 μl | 7,5 U/reakcia |
| Bst V2 DNA polymeráza (8U/μl) | 1 μl | 8 U/reakcia |
| MgS04 (100 mM) | 1,5 μl | 6 mM (celkovo 8 mM) |
| 10×HC RTL Buffer (alebo 10×HC Bst V2 Buffer) | 2,5 μl | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Voda bez nukleázy | Až 25 μl | - |
Poznámky:
1) Zmiešajte na vortexe a krátko odstreďte, aby ste zhromaždili.Inkubácia pri konštantnej teplote pri 65 °C počas 1 hodiny.
2) Tieto dve vyrovnávacie pamäte sú interoperabilné a majú rovnaké zloženie.
Poznámky
1. Tento produkt vytvorí pri skladovaní pri -20 °C bielu pevnú látku.Vyberieme z -20°C a dáme na ľad asi na 10 minút.Po roztopení sa môže použiť pretrepaním a miešaním.
2. Produkt cDNA sa môže skladovať pri -20 °C alebo -80 °C alebo sa môže ihneď použiť na reakciu PCR.
3. Aby ste predišli kontaminácii RNázou, udržiavajte experimentálnu oblasť čistú a počas prevádzky noste čisté rukavice a masky.
