Proteináza K mNGS (tekutá)
Proteináza K je stabilná serínová proteáza so širokou substrátovou špecifickosťou.Odbúrava mnohé bielkoviny v natívnom stave aj v prítomnosti detergentov.Dôkazy zo štúdií kryštálovej a molekulárnej štruktúry naznačujú, že enzým patrí do rodiny subtilizínov s katalytickou triádou aktívneho miesta (Asp39-Jeho69-Ser224).Prevládajúcim miestom štiepenia je peptidová väzba susediaca s karboxylovou skupinou alifatických a aromatických aminokyselín s blokovanými alfa-aminoskupinami.Bežne sa používa pre svoju širokú špecifickosť.Táto proteináza K je špeciálne navrhnutá pre mNGS.V porovnaní s inou proteinázou K obsahuje ešte menej kontaminácie nukleovými kyselinami s rovnakým enzymatickým výkonom, čo by mohlo lepšie zabezpečiť následnú aplikáciu mNGS.
Podmienky skladovania
2-8 ℃ počas 2 rokov
Špecifikácia
| Vzhľad | Bezfarebná až svetlohnedá kvapalina |
| Aktivita | ≥800 U/ml |
| Koncentrácia bielkovín | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Žiadne zistené |
| DNase | Žiadne zistené |
| RNáza | Žiadne zistené |
Vlastnosti
| EC číslo | 3.4.21.64(Rekombinant z albumu Tritirachium) |
| Izoelektrický bod | 7,81 |
| Optimálne pH | 7,0- 12,0 Obr |
| Optimálna teplota | 65 ℃ Obr. 2 |
| pH stabilita | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 h) Obr. 3 |
| Tepelná stabilita | Pod 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Obr. 4 |
| Stabilita pri skladovaní | Viac ako 90 % aktivity počas 12 mesiacov pri 25 ℃ |
| Aktivátory | KBÚ, močovina |
| Inhibítory | diizopropyl fluórfosfát;fenylmetylsulfonylfluorid |
Aplikácie
1. Genetická diagnostická súprava
2. Súpravy na extrakciu RNA a DNA
3. Extrakcia nebielkovinových zložiek z tkanív, degradácia bielkovinových nečistôt, ako je DNAvakcíny a príprava heparínu
4. Príprava chromozómovej DNA pulznou elektroforézou
5. Western blot
6. In vitro diagnostika enzymatických glykozylovaných albumínov
Prevencia
Pri používaní alebo vážení noste ochranné rukavice a okuliare a po použití dobre vetrajte.Tento produkt môže spôsobiť kožnú alergickú reakciu a vážne podráždenie očí.Pri vdýchnutí môže spôsobiť príznaky alergie alebo astmy alebo dýchavičnosť.Môže spôsobiť podráždenie dýchacích ciest.
Definícia jednotky
Jedna jednotka (U) je definovaná ako množstvo enzýmu potrebného na hydrolýzu kazeínu za vzniku 1 μmoltyrozínu za minútu za nasledujúcich podmienok.
Príprava činidiel
Činidlo I: 1 g mliečneho kazeínu bol rozpustený v 50 ml 0,1 M roztoku fosforečnanu sodného (pH 8,0), inkubovaný v 65-70 °C vody počas 15 minút, miešaný a rozpustený, ochladený vodou, upravený hydroxidom sodným na pH 8,0 a fixovaný objem 100 ml.
Činidlo II: 0,1 M kyselina trichlóroctová, 0,2 M octan sodný, 0,3 M kyselina octová.
Činidlo III: 0,4M Na2CO3Riešenie.
Činidlo IV: Činidlo Forint riedené čistou vodou 5-krát.
Činidlo V: Enzýmové riedidlo: 0,1 M roztok fosforečnanu sodného (pH 8,0).
Činidlo VI: roztok tyrozínu: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tyrozínu rozpustený s 0,2M HCl.
Postup
1. 0,5 ml činidla I sa predhreje na 37 °C, pridá sa 0,5 ml roztoku enzýmu, dobre sa premieša a inkubuje sa pri37 °C počas 10 minút.
2. Na zastavenie reakcie pridajte 1 ml činidla II, dobre premiešajte a pokračujte v inkubácii 30 minút.
3. Odstreďte reakčný roztok.
4. Vezmite 0,5 ml supernatantu, pridajte 2,5 ml činidla III, 0,5 ml činidla IV, dobre premiešajte a inkubujte pri 37 °Cna 30 min.
5. OD660bola určená ako OD1;slepá kontrolná skupina: 0,5 ml činidla V sa použije na nahradenie enzýmuriešenie na určenie OD660ako OD2, AOD=OD1-OD2.
6. Štandardná krivka L-tyrozínu: 0,5 ml roztoku L-tyrozínu rôznej koncentrácie, 2,5 ml činidla III, 0,5 ml činidla IV v 5 ml centrifugačnej skúmavke, inkubovať pri 37 °C počas 30 minút, detekovať OD660pre rôzne koncentrácie L-tyrozínu sa potom získa štandardná krivka Y=kX+b, kde Y je koncentrácia L-tyrozínu, X je OD600.
Kalkulácia
2: Celkový objem reakčného roztoku (ml)
0,5: Objem roztoku enzýmu (ml)
0,5: Objem reakčnej kvapaliny použitý pri chromogénnom stanovení (ml)
10: Reakčný čas (min)
Df: Viacnásobné riedenie
C: Koncentrácia enzýmu (mg/ml)
Referencie
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.komun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.a spol.,Eur.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet spol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydanie, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Figúrky
Obr.1 Optimálne pH
100 mM tlmivý roztok: pH 6,0-8,0, fosforečnan sodný;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH 9,0-12,5, glycín-NaOH. Koncentrácia enzýmu: 1 mg/ml
Obr.2 Optimálna teplota
Reakcia v 20 mM K-fosfátovom pufri pH 8,0.Koncentrácia enzýmu: 1 mg/ml
Obr.3 pH Stabilita
25 °C, 16 h-ošetrenie 50 mM tlmivým roztokom: pH 4,5-5,5, acetát;pH 6,0-8,0, fosforečnan sodný;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, glycín-NaOH.Koncentrácia enzýmu: 1 mg/ml
Obr.4 Tepelné stabilitu
30 minútové ošetrenie s 50 mM Tris-HCl pufrom, pH 8,0.Koncentrácia enzýmu: 1 mg/ml
Obr.5 Skladovanie stabilizovaťty at 25 ℃
