Mini súprava na extrakciu DNA
Táto súprava využíva optimalizovaný tlmivý systém a technológiu purifikačnej kolóny silikagélu, ktorá dokáže získať fragmenty DNA s veľkosťou 70 bp – 20 kb z rôznych koncentrácií agarózového gélu TAE alebo TBE.DNA adsorpčná kolóna môže špeciálne adsorbovať DNA v podmienkach s vysokým obsahom soli.Okrem toho môže súprava priamo purifikovať fragmenty DNA z produktov PCR, enzymatických reakčných systémov alebo produktov surovej DNA získaných inými metódami a odstraňovať nečistoty, ako sú proteíny, iné organické zlúčeniny, ióny anorganických solí a oligonukleotidové priméry.Môže zabezpečiť, že čistenie môže byť dokončené do 10-15 minút.Purifikovaná DNA sa môže použiť priamo na ligáciu, transformáciu, štiepenie enzýmov, in vitro transkripciu, PCR, sekvenovanie, mikroinjekciu atď.
Podmienky skladovania
Skladujte pri -15 ~ -25 ℃ a prepravujte pri izbovej teplote.
Komponenty
| Komponenty | (100 rxns) |
| Nárazník HDP | 80 ml |
| Buffer GW | 2 × 20 ml |
| Elution Buffer | 20 ml |
| Mini stĺpce FastPure DNA-G | 100 |
HDP vyrovnávacej pamäte:DNA viažuci pufor.
GW vyrovnávacej pamäte:Premývací pufor;pred použitím pridajte absolútny etanol podľa objemu uvedeného na fľaši.
Elučný pufer:Elúcia.
FastPure DNA Mini Columns-G:DNA adsorpčné kolóny.
Odberové skúmavky 2 ml:Zberné skúmavky na filtrát.
Pripravené materiály
1,5 ml sterilizované skúmavky, absolútny etanol a izopropanol (keď fragment DNA ≤100 bp, pridajte 1 objem
izopropanol na 1 objemový gél), vodný kúpeľ.
Experimentálny proces
Pred použitím pridajte 80 ml etanolu do zriedeného tlmivého roztoku GW, ako je uvedené na štítku, skladujte pri izbovej teplote.
Mechanizmus
1. PCR reakčný roztok
Schéma gélovej extrakcie: Pridajte rovnaký objem Schéma obnovy reakčného roztoku pufra GDP:Pridajte 5-násobok objemu pufra
2. HDP Vypočítajte objem gélu (100 μl sa rovná 100 mg)
Rozpustite gél
3. Predhrejte na 50 ~ 55℃
4. Bind Wash
Pridajte 300 μl pufra GDP*
Pridajte 700 μl pufra GW
Pridajte 700 μl pufra GW
5. Elute
Pridajte 20 – 30 μl Elution Buffer alebo deionizovanej vody
Poznámky* Regenerácia reakčnej tekutiny PCR bez tohto kroku
Program extrakcie gélu
1. Po elektroforéze DNA na frakcionáciu fragmentov DNA vyrežte jeden prúžok fragmentu DNA z agarózového gélu pod UV svetlom.Odporúča sa použiť savý papier na absorbovanie zdanlivej vlhkosti gélu a minimalizovanie veľkosti plátku gélu odstránením prebytočnej agarózy podľa možnosti.Odvážte rez gélu (bez mikrocentrifugačnej skúmavky), aby ste vypočítali jeho objem: Objem 100 mg gélového rezu je približne 100 μl za predpokladu, že hustota je 1 g/ml.
2. Pridajte rovnaký objem pufra GDP, inkubujte pri 50~55°C počas 7-10 minút (podľa veľkosti gélu upravte inkubačný čas, kým sa gél úplne nerozpustí).Počas inkubácie 2-krát prevráťte skúmavku.
Δ Pridanie 1-3 objemov pufra GDP neovplyvní účinnosť obnovy DNA.Ak fragment DNA, ktorý sa má získať, <100 bp, je potrebné pridať 3 objemy pufra GDP;keď sa plátok gélu úplne rozpustí, pridajte 1 objem izopropanolu a dôkladne premiešajte, potom pokračujte ďalším krokom.
3. Krátko centrifugujte, aby sa vzorka dostala na dno skúmavky, vložte FastPure DNA Mini Columns-G do odberových skúmaviek 2 ml, opatrne preneste roztok maximálne 700 μl raz za rok.
čas na filtračné kolóny, centrifugujte pri 12 000 ot./min (13 800 x g) počas 30-60 sekúnd.
4. Filtrát zlikvidujte a pridajte 300 μl pufra GDP do kolóny, inkubujte pri teplote miestnosti 1 minútu, centrifugujte pri 12 000 ot./min. (13 800 x g) 30-60 sekúnd.
5. Filtrát zlikvidujte a pridajte 700 μl tlmivého roztoku GW (skontrolujte vopred, či bol pridaný absolútny etanol!) do kolóny, centrifugujte pri 12 000 ot./min (13 800 x g) 30-60 sekúnd.
Δ Pridajte tlmivý roztok GW okolo steny adsorpčnej kolóny alebo pridajte zadný kryt tlmivého roztoku GW a 2 – 3-krát ho premiešajte hore nohami, aby ste úplne vypláchli soľ prilepenú na stene skúmavky.
6. Opakujte krok 5.
Δ Dvojité prepláchnutie pufrom GW môže zabezpečiť úplné odstránenie soli a eliminovať vplyv na nasledujúce experimenty.
7. Odstráňte filtrát a centrifugujte prázdnu kolónu pri 12 000 otáčkach za minútu (13 800 x g) počas 2 minút.
8. Vložte kolónu do čistej 1,5 ml mikrocentrifugačnej skúmavky, do stredu membrány kolóny pridajte 20 – 30 μl elučného pufra, inkubujte 2 minúty a potom centrifugujte pri 12 000 otáčkach za minútu (13 800 x g) 1 minútu.Stĺpec zlikvidujte, získanú DNA skladujte pri -20 °C.
Δ Prenesenie supernatantu z kroku 8 do kolóny na opätovnú elúciu a predhriatie elučného pufra na 55 (keď fragment DNA > 3 kb) môže pomôcť zvýšiť účinnosť regenerácie.
Program obnovy produktov PCR
Tento protokol je použiteľný na purifikáciu fragmentov DNA z produktov PCR, enzymatického reakčného systému a iných surových produktov DNA (vrátane genetickej DNA).Tento roztok dokáže účinne odstrániť rôzne nukleotidy, priméry, diméry primérov, molekuly solí, enzýmy a iné nečistoty.
1. Krátko centrifugujte produkty PCR, roztok enzymatickej reakcie a iné surové produkty DNA.Pipetou odhadnite ich objem a preneste do sterilizovanej 1,5 ml alebo 2 ml skúmavky.Pridajte ddH2O do objemu 100 μl;zatiaľ čo v prípade genómovej DNA s vysokou koncentráciou pomôže zriedenie na 300 μl ddH2O zlepšiť účinnosť regenerácie.
2. Pridajte 5 objemov pufra GDP, dôkladne premiešajte prevrátením alebo pretrepaním.Ak je požadovaný fragment DNA > 100 bp, je potrebné pridať ďalších 1,5 objemu (vzorky + HDP pufra) etanolu.
3. Vložte kolónu späť do zbernej skúmavky, preneste zmes do kolóny, centrifugujte pri 12 000 ot./min (13 800 × g) 30 – 60 sekúnd.Ak je objem zmiešaného roztoku >700 µl, vložte adsorpčnú kolónu späť do zbernej skúmavky, preneste zvyšný roztok do adsorpčnej kolóny a centrifugujte pri 12 000 ot./min (13 800 × g) 30 – 60 sekúnd.
4. Ďalší postup sa vzťahuje na krok 5 – 8 z 08-1/Program extrakcie gélu.
Aplikácie
Rôzne koncentrácie TAE alebo TBE agarózového gélu;Produkty PCR, enzymatické reakčné systémy alebo iné produkty surovej DNA získané rôznymi metódami.Získané fragmenty sa pohybovali od70 bp - 20 kb.
Poznámky
Len na výskumné použitie.Nepoužívať pri diagnostických postupoch.
1. Pred použitím pridajte 80 ml etanolu do zriedeného tlmivého roztoku GW, ako je uvedené na štítku, skladujte pri izbovej teplote.
2. Ak sa tlmivý roztok GDP ľahko vyzráža počas skladovania pri nízkej teplote, možno ho pred použitím na určitý čas umiestniť pri izbovej teplote.V prípade potreby sa môže predhriať vo vodnom kúpeli s teplotou 37 °C, kým sa zrazenina úplne nerozpustí, a potom sa môže po zmiešaní použiť.
3. Vopred nastavte teplotu vodného kúpeľa na 50 ~ 55 °C.
4. V 08-1/programe extrakcie gélu, krok 1, minimalizácia veľkosti rezu gélu výrazne skráti čas rozpúšťania a zvýši účinnosť regenerácie (linearizovaná DNA sa ľahko hydrolyzuje, keď je neustále vystavená vysokej teplote).DNA gél nevystavujte UV žiareniu na dlhú dobu, pretože ultrafialové svetlo môže spôsobiť poškodenie DNA.
5. Gél úplne rozpustite v 08-1/programe extrakcie gélu, krok 2, inak bude účinnosť obnovy DNA vážne ovplyvnená.
6. Predhrejte Elution Buffer alebo ddH2O na 55 °C, čo je užitočné na zlepšenie účinnosti elúcie DNA.Odporúča sa uchovávať DNA v eluente 2,5 mM Tris-HCl, pH 7,0 – 8,5.
