5× Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Kat. č: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) je vysoko stabilná zmes na báze sondy s jednou skúmavkou vhodná na jednokrokovú reverznú transkripciu a kvantitatívnu PCR (qRT-PCR).Podporuje predmiešanie primerov a sond a zostáva stabilný po dlhom skladovaní pri nízkej teplote.Vzorka, ktorá sa má testovať, sa môže pridať priamo pri použití bez dodatočného otvárania skúmavky/pipetovania.Tento produkt obsahuje zložky, napr. hot-start DNA polymerázu, M-MLV, tepelne labilnú uracil DNA glykosylázu (TS-UNG), inhibítor RNázy, MgCl2dNTP (s dUTP namiesto dTTP) a stabilizátory.Pomocou geneticky modifikovanej rýchlej amplifikačnej reverznej transkriptázy a DNA polymerázy je možné dokončiť PCR amplifikáciu v priebehu 20-40 minút.Toto činidlo používa špeciálny pufer pre qPCR so zmiešanými enzýmami anti-inhibičného amplifikačného enzýmu a enzýmu UNG.Preto môže dosiahnuť dobrú amplifikáciu cieľových génov a zabrániť falošnej amplifikácii spôsobenej zvyškovým a aerosólovým znečistením PCR.Toto činidlo je kompatibilné s väčšinou fluorescenčných kvantitatívnych PCR prístrojov od výrobcov ako Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad a Roche.
Komponent
1.25× Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5× Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Podmienky skladovania
Všetky komponenty by sa mali uchovávať pri teplote -20 °C na dlhodobé skladovanie a pri teplote 4 °C až 3 mesiace.Po rozmrazení dôkladne premiešajte a pred použitím odstreďte.Vyhnite sa častému zmrazovaniu a rozmrazovaniu.
Príprava reakčného systému qRT-PCR
| Komponenty | 25μLSystém | 50μLSystém | Konečná koncentrácia |
| 5× Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5 μl | 10 μl | 1× |
| 25× Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1 μl | 2 μl | 1× |
| 25 x zmes primer-probea | 1 μl | 2 μl | 1× |
| Šablóna RNAb | – | – | – |
| ddH2O | Až 25 μl | Až 50 μl | – |
1) a. Konečná koncentrácia primeru je zvyčajne 0,2 μM.Pre lepšie výsledky môže byť koncentrácia primeru optimalizovaná v rozsahu 0,2-1 μM.Vo všeobecnosti možno koncentráciu sondy optimalizovať v rozsahu 0,1 až 0,3 uM.
2) b. Pri použití rýchleho postupu PCR môže zvýšenie koncentrácie primérov a sond viesť k lepším výsledkom amplifikácie a ich pomer by sa mal zodpovedajúcim spôsobom optimalizovať.
3) Rôzne typy vzoriek obsahujú rôzne typy a obsah inhibítora a počet kópií cieľového génu.Objem vzorky by sa mal posudzovať podľa skutočného stavu.V prípade potreby vzorku zriedte vodou bez nukleázy alebo pufrom TE.
Reakcia Cpodmienky
| Pravidelný postup PCR | Rýchly postup PCR | ||||||
| Postup | tepl. | čas | Cyklus | Postup | tepl. | čas | Cyklus |
| Reverzný prepis | 50 ℃ | 10-20 min | 1 | Reverzný prepis | 50 ℃ | 5 min | 1 |
| Polymeráza Aktivácia | 95 ℃ | 1-5 min | 1 | Polymeráza Aktivácia | 95 ℃ | 30-te roky | 1 |
| Denaturácia | 95 ℃ | 10-20s | 40-50 | Denaturácia | 95 ℃ | 1-3s | 40-50 |
| Žíhanie a Rozšírenie | 56-64 °C | 20-60 rokov | Žíhanie a Rozšírenie | 56-64 °C | 3-20s | ||
Kontrola kvality
1.Funkčná detekcia: citlivosť, špecifickosť a opakovateľnosť qPCR.
2.Žiadna exogénna nukleázová aktivita: žiadne znečistenie exogénnou endonukleázou a exonukleázou.
Poznámky
1.Rýchlosť amplifikácie rýchlej DNA polymerázy nie je menšia ako 1 kb/10 s.Rôzne PCR prístroje majú rôzne rýchlosti ohrevu a chladenia, režimy regulácie teploty a tepelnú vodivosť, a preto je nevyhnutná optimalizácia koncentrácie priméru/sondy a metódy behu v kombinácii s vaším špecifickým rýchlym PCR prístrojom.
2.Tento produkt má širokú použiteľnosť a je vhodný pre vysoko citlivú molekulárnu diagnostiku.Metóda trojkrokovej PCR sa odporúča pre priméry s nízkou teplotou nasadenia alebo pre amplifikáciu dlhých fragmentov nad 200 bp.
3.Keďže rôzne amplikóny majú rôznu účinnosť využitia dUTP a rôznu citlivosť na UNG, reagencie by sa mali optimalizovať, ak sa citlivosť detekcie zníži pri použití systému UNG.V prípade potreby nás kontaktujte pre technickú podporu.
4.Aby sa predišlo amplifikácii prenosných produktov PCR, na amplifikáciu je potrebná vyhradená experimentálna oblasť a pipeta.Pracujte v rukaviciach a často vymieňajte a neotvárajte skúmavku PCR po amplifikácii.
