2× Sensi Direct Premix-UNG (Probe qPCR)
Kat. č: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) je určený na vykonávanie PCR priamo zo vzoriek bez extrakcie DNA alebo prípravy vzorky.Toto činidlo pozostáva z hot-start DNA polymerázy, uracil DNA glykozylázy (UNG), inhibítora RNázy, MgCl2dNTP (s dUTP namiesto dTTP) a stabilizátory pre kvantitatívnu PCR (qPCR).Toto činidlo vytvára vysokú toleranciu inhibítora, a preto ho možno priamo použiť na detekciu vzoriek, ako sú výtery z hrdla, sliny, antikoagulovaná plná krv, plazma a sérum bez extrakcie DNA.Činidlo používa vlastný pufer pre qPCR so zmiešanými enzýmami anti-inhibičnej DNA polymerázy a enzýmu UNG.Preto môže získať dobrú amplifikáciu cieľových génov vo vzorkách obsahujúcich inhibítory a inhibovať falošne pozitívnu amplifikáciu spôsobenú reziduálnym PCR a aerosólovým znečistením.Toto činidlo je kompatibilné s väčšinou fluorescenčných kvantitatívnych PCR prístrojov, ako sú Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche atď.
Komponenty
1. Zmes 50×SensiDirect Enzyme/UNG
2. 2× SensiDirect Premix Buffer (dUTP)
Podmienky skladovania
Všetky komponenty by sa mali uchovávať pri teplote -20 °C na dlhodobé skladovanie a pri teplote 4 °C až 3 mesiace.Po rozmrazení dôkladne premiešajte a pred použitím odstreďte.Vyhnite sa častému zmrazovaniu a rozmrazovaniu.
Cyklistický protokol
| Krok | Teplota | čas | Cyklus |
| Trávenie | 50 ℃ | 2 min | 1 |
| Aktivácia polymerázy | 95 ℃ | 1-5 min | 1 |
| Denaturácia | 95 ℃ | 10-20s | 40-50 |
| Žíhanie/Predlžovanie | 56-64 °C | 20-60 rokov |
Pokyny na pipetovanie
| Činidlo | Objem za reakciu | Objem na reakciu | Konečná koncentrácia |
| 2× SensiDirect Premix Buffer (dUTP) | 12,5 ul | 25 ul | 1× |
| 50× SensiDirect Enzyme/UNG Mix | 0,5 ul | 1 ul | 1× |
| 25 x zmes primer-probe1, 2 | 1 ul | 2 ul | 1× |
| Ukážka3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Celkový objem | 25 ul | 50 ul | - |
1. Konečná koncentrácia primeru je zvyčajne 0,2 μM.Pre lepšie výsledky môže byť koncentrácia primeru optimalizovaná v rozsahu 0,2-1 μM.
2. Vo všeobecnosti možno koncentráciu sondy optimalizovať v rozsahu 0,1-0,3μM.Optimálna koncentrácia sondy súvisí s prístrojom na amplifikáciu PCR v reálnom čase, typom sondy a typom fluorescenčnej značiacej látky.Pozrite si príručku k prístroju alebo špecifické požiadavky každej fluorescenčnej sondy.
3. Rôzne typy vzoriek obsahujú rôzne typy a obsah inhibítora a počet kópií cieľového génu.Objem vzorky by sa mal posudzovať podľa skutočného stavu.Vzorku zriedte pridaním vody bez nukleázy alebo pufra TE, ak je to potrebné.
4. Odporúčaný objem rôznych vzoriek:
| Ukážka | Objem za jednu 50 μL reakciu | Maximálne pomer |
| Antikoagulovaná plná krv | 2,5 μl | 5% |
| Plazma | 15 ul | 30 % |
| Sérum | 10 μl | 20 % |
| Výter z hrdla | 10 μl | 20 % |
| Sliny | 10 μl | 20 % |
Kontrola kvality
1. Detekcia funkcie: citlivosť, špecifickosť a opakovateľnosť qPCR.
2. Žiadna exogénna nukleázová aktivita: žiadne znečistenie exogénnou endonukleázou a exonukleázou.
Poznámky k produktu
1. Tento produkt využíva nový typ hot-start DNA polymerázy, ktorá môže byť aktivovaná za 1-5 minút. Keďže jeho reakčný pufor bol optimalizovaný, je vhodnejší pre dvojitú alebo viacnásobnú fluorescenčnú kvantitatívnu PCR s použitím sondovej metódy.
2. Ak je hodnota Rn amplifikácie PCR príliš nízka alebo je amplifikácia zjavne inhibovaná, výsledky môže zlepšiť zníženie množstva vzorky, zvýšenie reakčného objemu alebo predchádzajúce zriedenie vzorky.
3. Odber krvi, slín, moču, výteru z hrdla atď. by sa mal riadiť požiadavkami klinických kritérií a čerstvá vzorka sa môže použiť na prevenciu degradácie nukleovej kyseliny.
4. Keďže rôzne amplikóny majú rôznu účinnosť využitia ako dUTP a citlivosť na UNG, reagencie by sa mali optimalizovať, ak sa citlivosť detekcie zníži pri použití systému UNG.V prípade potreby nás kontaktujte pre technickú podporu.
5. Aby sa predišlo amplifikácii produktov PCR medzi jednostupňovými reakciami, na amplifikáciu je potrebná špeciálna experimentálna oblasť a pipeta.Pracujte v rukaviciach a často vymieňajte a neotvárajte reakčnú skúmavku po amplifikácii PCR.
