Enzým obmedzujúci vírus vakcínie

Krycí enzým vírusu vakcínie je odvodený z rekombinantného kmeňa E. coli, ktorý nesie gény pre uzatvárací enzým vakcínie.Tento jediný enzým sa skladá z dvoch podjednotiek (D1 a D12) a má tri enzymatické aktivity (RNA trifosfatáza a guanylyltransferáza podjednotkou D1 a guanínmetyltransferáza podjednotkou D12).Capping Enzyme vírusu vakcínie je účinný pri katalyzovaní tvorby čiapočkovej štruktúry, ktorá môže špecificky pripojiť 7-metylguanylátovú čiapočkovú štruktúru (m7Gppp, Cap 0) na 5' koniec RNA.Cap štruktúra (Cap 0) hrá dôležitú úlohu pri stabilizácii, transporte a translácii mRNA v eukaryotoch.Capping RNA enzymatickou reakciou je účinná a jednoduchá metóda, ktorá môže výrazne zlepšiť stabilitu a transláciu RNA pre in vitro transkripciu, transfekciu a mikroinjekciu.

Komponenty

Enzým uzatvárajúci vírus vakcínie (10 U/μl)

10 × uzatvárací pufer

Podmienky skladovania

-25～- 15℃ na skladovanie （Vyhnite sa opakovaným cyklom zmrazovania a rozmrazovania）

Vyrovnávacia pamäť

20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl,

1 mM DTT, 0, 1 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 50 % glycerol.

Definícia jednotky

Jedna jednotka krycieho enzýmu vírusu vakcínie je definovaná ako množstvo enzýmu potrebného na začlenenie 10 pmol GTP do 80nt transkriptu za 1 hodinu pri 37 °C.

Kontrola kvality

Exonukleáza:10 U krycieho enzýmu vírusu vakcínie s 1 μg λ-Hind III štiepenej DNA pri 37 °C počas 16 hodín nevedie k žiadnej degradácii, ako sa stanovilo elektroforézou na agarózovom géli.

Endonukleáza:10 U krycieho enzýmu vírusu vakcínie s 1 μg λDNA pri 37 °C počas 16 hodín nevedie k žiadnej degradácii, ako sa stanovilo elektroforézou na agarózovom géli.

Nickase:10 U krycieho enzýmu vírusu vakcínie s 1 ug pBR322 pri 37 °C počas 16 hodín nevedie k žiadnej degradácii, ako sa stanovilo elektroforézou na agarózovom géli.

RNáza:10 U krycieho enzýmu vírusu vakcínie s 1,6 μg MS2 RNA počas 4 hodín pri 37 °C nevedie k žiadnej degradácii, ako sa stanovilo elektroforézou na agarózovom géli.

1.coli DNA:10 U Capping Enzyme vírusu vakcínie sa skrínuje na prítomnosť genómovej DNA E. coli pomocou TaqMan qPCR s primérmi špecifickými pre lokus rRNA E. coli 16S.Kontaminácia genómovej DNA E. coli je ≤ 1 genóm E. coli.

2.Bakteriálne Endotoxín: LAL-test, podľa Čínskeho liekopisu IV 2020, metóda gélového limitného testu, všeobecné pravidlo (1143).Obsah bakteriálneho endotoxínu by mal byť ≤ 10 EU/mg.

Reakčný systém a podmienky

1. Protokol uzatvárania (reakčný objem: 20 μl)

Tento postup je použiteľný na uzatváraciu reakciu 10 μg RNA (≥100 nt) a môže byť zväčšený podľa experimentálnych požiadaviek.

I) Skombinujte 10 μg RNA a H2O bez nukleázy v 1,5 ml mikrocentrifugačnej skúmavke na konečný objem 15,0 μl.*10 x uzatvárací pufor: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCI, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 °C, pH 8,0)

2) Zahrievajte na 65 °C počas 5 minút a následne na ľadový kúpeľ počas 5 minút.

3) Pridajte nasledujúce komponenty v určenom poradí

*10 x uzatvárací pufor: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCI, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 °C, pH 8,0)

4) Inkubujte pri 37 °C 30 minút, RNA je teraz uzavretá a pripravená na následné aplikácie.

2. 5′ koncovka označovacia reakcia (objem reakcie: 20 μL)

Tento protokol je určený na značenie RNA obsahujúcej 5´ trifosfát a môže byť zväčšený podľa požiadaviek.Účinnosť inkorporácie značky bude ovplyvnená molárnym pomerom RNA:GTP, ako aj obsahom GTP vo vzorkách RNA.

1) Zmiešajte príslušné množstvo RNA a H2O bez nukleázy v 1,5 ml skúmavke pre mikrocentrifúgy na konečný objem 14,0 µl.

2) Zahrievajte na 65 °C počas 5 minút a následne na ľadový kúpeľ počas 5 minút.

3) Pridajte nasledujúce komponenty v určenom poradí.

** GTP MIX označuje GTP a malý počet markerov.Pre koncentráciu GTP pozrik poznámke 3.

4) Inkubujte pri 37 °C 30 minút, 5' koniec RNA je teraz označený a pripravený na downstream

Aplikácie

1. Zakrytie mRNA pred translačnými testami/in vitro transláciou

2. Označenie 5' konca mRNA

Poznámky k použitiu

1.Zahriatie roztoku RNA pred inkubáciou s enzýmom Vaccinia Capping Enzyme odstráni sekundárnu štruktúru na 5' konci transkriptu.Predĺžte čas na 60 minút pre prepisy so známymi vysoko štruktúrovanými 5´koncami.

2. RNA použitá na uzatváracie reakcie by mala byť pred použitím purifikovaná a suspendovaná vo vode bez nukleázy.EDTA by nemala byť prítomná a roztok by nemal obsahovať soli.

3. Na označenie 5' konca by celková koncentrácia GTP mala byť približne 1-3 násobok molárnej koncentrácie mRNA v reakcii.

4. Objem reakčného systému možno zväčšiť alebo zmenšiť podľa aktuálneho stavu.