PNGase F
Peptid-N-glykozidáza F (PNGáza F) je najúčinnejšou enzymatickou metódou na odstránenie takmer všetkých N-naviazaných oligosacharidov z glykoproteínov.PNGáza F je amidáza, ktorá štiepi medzi najvnútornejšími GlcNAc a asparagínovými zvyškami vysokomanózových, hybridných a komplexných oligosacharidov z N-naviazaných glykoproteínov.
Aplikácia
Tento enzým je užitočný na odstránenie sacharidových zvyškov z proteínov.
Príprava a špecifikácia
| Vzhľad | Bezfarebná kvapalina |
| Čistota bielkovín | ≥95 % (z SDS-PAGE) |
| Aktivita | ≥500 000 U/ml |
| Exoglykozidáza | Nebola zistená žiadna aktivita (ND) |
| Endoglykozidáza F1 | ND |
| Endoglykozidáza F2 | ND |
| Endoglykozidáza F3 | ND |
| Endoglykozidáza H | ND |
| Proteáza | ND |
Vlastnosti
| EC číslo | 3.5.1.52(Rekombinovaný z mikroorganizmov) |
| Molekulová hmotnosť | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Izoelektrický bod | 8. 14 |
| Optimálne pH | 7,0-8,0 |
| Optimálna teplota | 65 °C |
| Špecifickosť substrátu | Štiepenie glykozidických väzieb medzi GlcNAc a asparagínovými zvyškami Obr.1 |
| Uznávacie stránky | N-pripojené glykány, pokiaľ neobsahujú a1-3 fukózu Obr. 2 |
| Aktivátory | DTT |
| Inhibítor | KBÚ |
| Skladovacia teplota | -25 ~ -15 ℃ |
| Tepelná inaktivácia | 20 ul reakčnej zmesi obsahujúcej 1 ul PNGázy F sa inaktivuje inkubáciou pri 75 °C počas 10 minút. |
Obr. 1 Substrátová špecifickosť PNGázy F
Obr. 2 Rozpoznávanie PNGázy F.
Keď sú vnútorné GlcNAc zvyšky spojené s a1-3 fukózou, PNGáza F nemôže štiepiť N-pripojené oligosacharidy z glykoproteínov.Táto modifikácia je bežná u rastlín a niektorých hmyzích glykoproteínov.
Csúčasti
|
| Komponenty | Koncentrácia |
| 1 | PNGase F | 50 ul |
| 2 | 10× Glykoproteínový denaturačný pufor | 1000 ul |
| 3 | 10× glykobuffer 2 | 1000 ul |
| 4 | 10 % NP-40 | 1000 ul |
Definícia jednotky
Jedna jednotka (U) je definovaná ako množstvo enzýmu potrebného na odstránenie >95 % sacharidu z 10 ug denaturovanej RNázy B za 1 hodinu pri 37 °C v celkovom reakčnom objeme 10 ul.
Reakčné podmienky
1. Rozpustite 1-20 µg glykoproteínu v deionizovanej vode, pridajte 1 µl 10x glykoproteínového denaturačného pufra a H2O (ak je to potrebné), aby ste získali celkový reakčný objem 10 µl.
2.Inkubujte pri 100 °C 10 minút, ochlaďte na ľade.
3.Pridajte 2 ul 10 x GlycoBuffer 2, 2 ul 10 % NP-40 a premiešajte.
4.Pridajte 1-2 ul PNGázy F a H2O (ak je to potrebné), aby sa získal celkový reakčný objem 20 µl a premiešal sa.
5.Reakcia sa inkubuje pri 37 °C počas 60 minút.
6.Pre SDS-PAGE analýzu alebo HPLC analýzu.
