mRNA Cap2'-0-metyltransferáza

mRNA Cap 2´-O-metyltransferáza bola odvodená z rekombinantného kmeňa E. coli, ktorý nesie gén pre vakcíniu mRNA Cap 2´-O-metyltransferázu.Tento enzým pridáva metylovú skupinu na 2´-O pozíciu prvého nukleotidu susediaceho s cap štruktúrou na 5´konci RNA. Enzým využíva S-adenosylmetionín (SAM) ako metylový donor na metyláciu capated RNA (cap -0), čo vedie k štruktúre cap-1.

Štruktúra Cap1 môže zvýšiť účinnosť translácie, zlepšiť expresiu mRNA v experimentoch s transfekciou a mikroinjekciou. Tento enzým špecificky vyžaduje RNA s čiapočkou m7GpppN ako substrátom.Nemôže využiť RNA s pN, ppN, pppN alebo GpppN na 5' konci.Čapovaná RNA môže byť pripravená in vitro transkripciou s použitím cap analógu alebo prostredníctvom enzymatického cappingu s použitím Vaccinia Capping Enzyme.

Komponenty

mRNA Cap 2´-O-metyltransferáza (50 U/μl)

10 x uzatvárací reakčný pufor

Skladovanie

-25 ～- 15 ℃ na skladovanie （Vyhnite sa opakovaným cyklom zmrazovania a rozmrazovania）

Vyrovnávacia pamäť

20 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 °C), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 50 % glycerol.

Definícia jednotky

Jedna jednotka je definovaná ako množstvo enzýmu potrebného na metyláciu 10 pmolov 80 nt uzavretého RNA transkriptu za 1 hodinu pri 37 °C.

Testy kontroly kvality

Exonukleáza:50 U mRNA Cap 2'-O-metyltransferázy s 1 μg λ-Hind III štiepenej DNA pri 37 °C počas 16 hodín nevedie k žiadnej degradácii, ako bolo stanovené elektroforézou na agarózovom géli.

Endonukleáza: 50 U mRNA Cap 2'-O-metyltransferázy s 1 μg λDNA pri 37 °C počas 16 hodín nevedie k žiadnej degradácii, ako sa stanovilo elektroforézou na agarózovom géli.

Nickase: 50 U mRNA Cap 2'-O-metyltransferázy s 1 μg pBR322 pri 37 °C počas 16 hodín nevedie k žiadnej degradácii, ako bolo stanovené elektroforézou na agarózovom géli.

RNáza: 50 U mRNA Cap 2'-O-metyltransferázy s 1,6 μg MS2 RNA počas 4 hodín pri 37 °C nevedie k žiadnej degradácii, ako bolo stanovené elektroforézou na agarózovom géli.

E. coli DNA: 50 U mRNA Cap 2´-O-metyltransferázy sa skrínuje na prítomnosťE. coli genómovej DNA s použitím TaqMan qPCR s primérmi špecifickými preE. coli 16S rRNA lokus.TheE. coli kontaminácia genómovou DNA je =1E. coli genóm.

Bakteriálne Endotoxín: LAL-test, podľa Čínskeho liekopisu IV 2020, metóda gélového limitného testu, všeobecné pravidlo (1143).Obsah bakteriálneho endotoxínu by mal byť = 10 EU/mg.

Reakčný systém a podmienky

1. V 1,5 ml mikroodstredivkovej skúmavke skombinujte vhodné množstvo RNA s uzáverom a H2O bez RNázy do konečného objemu 16,0 µl.

2. Zahrievajte na 65 °C počas 5 minút a potom na ľadový kúpeľ počas 5 minút.

3. Pridajte nasledujúce zložky v uvedenom poradí (na metyláciu CApped RNA

menej ako 10

*10x uzatvárací reakčný pufor: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 °C), 50 mM KCI, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT.

4. Inkubujte pri 37 °C 1 hodinu (2 hodiny inkubácie sa odporúčajú pre cieľový fragment menší ako 200 nt).

Aplikácie

Na zlepšenie expresie mRNA počas experimentov s mikroinjekciou a transfekciou.

Poznámky k použitiu

1. Pred reakciou by mala byť RNA purifikovaná a rozpustená vo vode bez nukleázy, všetky roztoky by nemali obsahovať žiadnu EDTA a ióny.

2. Odporúča sa zahriať vzorku RNA na 65 °C počas 5 minút pred reakciou, aby sa odstránila sekundárna štruktúra na 5´ konci transkriptu.Pre komplexnú 5´-koncovú štruktúru by sa to dalo predĺžiť na 10 minút.