M-MLV Neoscript reverzná transkriptáza
Reverzná transkriptáza Neoscript je reverzná transkriptáza získaná skríningom mutácií génu M-MLV pôvodu a expresiou vírusu myšacej leukémie Moloney v E. coli.Enzým odstraňuje aktivitu RNázy H, má vyššiu teplotnú toleranciu a je vhodný na vysokoteplotnú reverznú transkripciu.Preto je nápomocný pri eliminácii nepriaznivých účinkov vysokoúrovňovej štruktúry RNA a nešpecifických faktorov na syntézu cDNA a má vyššiu stabilitu a schopnosť syntézy reverznej transkripcie.Enzým má vyššiu stabilitu a schopnosť syntézy reverznej transkripcie.
Komponenty
1.200 U/μl Neoscript reverzná transkriptáza
2.5 × vyrovnávacia pamäť prvého vlákna (voliteľné)
* 5 × tlmivý roztok prvého vlákna neobsahuje dNTP, pridajte dNTP pri príprave reakčného systému
Odporúčaná aplikácia
1.Jednokroková qRT-PCR.
2.Detekcia RNA vírusu.
Skladovací stav
-20°C na dlhodobé skladovanie, pred použitím treba dobre premiešať, vyhýbať sa častému zmrazovaniu a rozmrazovaniu.
Definícia jednotky
Jedna jednotka obsahuje 1 nmol dTTP za 10 minút pri 37 °C s použitím poly(A)•oligo(dT)25ako šablóna/primer.
Kontrola kvality
1.Elektroforetická čistota SDS-PAGE vyššia ako 98 %.
2.Citlivosť zosilnenia, kontrola medzi dávkami, stabilita.
3.Žiadna exogénna nukleázová aktivita, žiadna exogénna endonukleáza alebo kontaminácia exonukleázou
Nastavenie reakcie pre riešenie prvej reťazovej reakcie
1.Príprava reakčnej zmesi
| Komponenty | Objem |
| oligo(dT)12-18 Primer alebo Random Primera Alebo génovo špecifické primeryb | 50 pmol |
| 50 pmol (20 – 100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μl |
| Šablóna RNA | Celková RNA ≤ 5 μg;mRNA ≤ 1 μg |
| dH bez RNázy2O | Do 10 μl |
Poznámky:a/b: Vyberte rôzne typy primerov podľa vašich experimentálnych potrieb.
2.Zahrievajte na 65 °C počas 5 minút a rýchlo ochladzujte na ľade počas 2 minút.
3.Do vyššie uvedeného systému pridajte nasledujúce zložky do celkového objemu 20 µl a jemne premiešajte:
| Komponenty | Hlasitosť (μL) |
| 5 × vyrovnávacia pamäť prvého vlákna | 4 |
| Neoscript reverzná transkriptáza (200 U/μl) | 1 |
| Inhibítor RNázy (40 U/μl) | 1 |
| dH bez RNázy2O | Do 20 μl |
4. Vykonajte reakciu podľa nasledujúcich podmienok:
(1) Ak sa použije Random Primer, reakcia by sa mala uskutočniť pri 25 °C počas 10 minút a potom pri 50 °C počas 30 až 60 minút;
(2) Ak sa použije Oligo dT alebo špecifické priméry, reakcia by sa mala uskutočniť pri 50 °C počas 30 až 60 minút.
5.Zahrievajte na 95 °C počas 5 minút, aby ste inaktivovali Neoscript reverznú transkriptázu a ukončili reakciu.
6.Produkty reverznej transkripcie môžu byť použité priamo v PCR reakcii a fluorescenčnej kvantitatívnej PCR reakcii alebo môžu byť dlhodobo skladované pri -20 °C.
PCR Rakcia:
1.Príprava reakčnej zmesi
| Komponenty | Koncentrácia |
| 10 × PCR pufer (bez dNTP, bez Mg²+) | 1× |
| dNTP (10 mM každý dNTP) | 200 uM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA polymeráza (5U/μl) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 uM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 uM |
| Šablónaa | ≤ 10 % roztok prvej reťazovej reakcie (2 μl) |
| ddH2O | Do 50 μl |
Poznámky:a: Ak sa pridá príliš veľa roztoku prvej reťazovej reakcie, reakcia PCR môže byť inhibovaná.
2.Postup PCR reakcie
| Krok | Teplota | čas | Cykly |
| Preddenaturácia | 95 ℃ | 2-5 min | 1 |
| Denaturácia | 95 ℃ | 10-20 sek | 30-40 |
| Žíhanie | 50-60 ℃ | 10-30 sek | |
| Rozšírenie | 72 ℃ | 10-60 sekúnd |
Poznámky
1.Vhodné na optimalizáciu teploty reverznej transkripcie v rozsahu 42℃~55℃.
2.Má lepšiu stabilitu, je vhodný na vysokoteplotnú reverznú transkripčnú amplifikáciu.Okrem toho je výhodný pre účinný prechod cez komplexné štruktúrne oblasti RNA.Tiež toje vhodný na jednokrokovú multiplexnú fluorescenčnú kvantitatívnu detekciu RT-PCR.
3.Dobrá kompatibilita s rôznymi PCR amplifikačnými enzýmami a je vhodný pre vysoko citlivé RT-PCR reakcie.
4.Vhodné pre vysoko citlivú jednokrokovú fluorescenčnú kvantitatívnu RT-PCR reakciu, účinne zlepšuje rýchlosť detekcie nízkej koncentrácie templátov.
5.Vhodné na konštrukciu cDNA knižnice.
