EndoFree Plazmid Maxi Kit
Táto súprava je vhodná na extrakciu zo 150 – 300 ml bakteriálneho roztoku kultivovaného cez noc pomocou vylepšenej metódy SDS-alkalickej lýzy na lýzu baktérií.Surový extrakt sa selektívne kombinuje s unikátnym zachytávačom endotoxínov a separuje sa centrifugáciou, aby sa odstránili endotoxíny.Potom sa silikagélová membrána selektívne viaže na plazmidovú DNA v roztoku v podmienkach vysokého obsahu soli a nízkeho pH.Potom nasleduje pridanie premývacieho pufra na odstránenie nečistôt a iných bakteriálnych zložiek.Nakoniec sa na elúciu čistej plazmidovej DNA zo silikónovej matrice použije elučný pufor s nízkym obsahom soli a vysokým pH.Silikagélová membrána využíva špeciálnu adsorpčnú membránu a rozdiel adsorpčného množstva medzi kolónou a kolónou je veľmi malý a opakovateľnosť je dobrá.Nevyžaduje sa fenol, chloroform a iné toxické činidlá a nie sú potrebné ani kroky zrážania etanolom.Táto súprava sa môže použiť na rýchlu extrakciu 0,2 – 1,5 mg čistej plazmidovej DNA s vysokou kópiou s mierou extrakcie 80 % – 90 %.Súprava využíva unikátny procesný vzorec na odstránenie endotoxínu, obsah endotoxínu je extrémne nízky a efekt bunkovej transfekcie je vynikajúci.Extrahovaný plazmid by sa mohol priamo použiť v enzymatickom štiepení, PCR, in vitro transkripcii, transformácii, sekvenovaní a iných experimentoch molekulárnej biológie.
Podmienky skladovania
RNaseA by sa mala skladovať pri teplote -30 ~ -15 °C a prepravovať pri teplote ≤0 °C.
Endotoxín Scavenger sa môže skladovať pri 2 ~ 8 ℃ počas jedného mesiaca, skladovaný pri -30 ~ -15 ℃ na dlhodobé skladovaniea prepravované pri ≤0℃.
Ostatné komponenty by sa mali skladovať pri izbovej teplote (15 ~ 25 ℃) a prepravovať pri izbovej teplote.
Komponenty
| Komponenty | 10RXNS |
| RNáza A | 750 ul |
| Buffer P1 | 75 ml |
| Buffer P2 | 75 ml |
| Buffer P4 | 75 ml |
| Scavenger endotoxínu | 25 ml |
| Buffer PW | 2 × 22 ml |
| Buffer TBC | 20 ml |
| Maxi stĺpce FastPure DNA (každá v 50 ml skúmavke na odber) | 10 |
| Odberná skúmavka bez endotoxínov | 2 × 5 |
RNázaA:10 mg/ml, používa sa na odstránenie RNA.
Buffer P1:bakteriálny suspenzný pufor, pred prvým použitím pridajte RNázuA do pufra P1.
Buffer P2:bakteriálny lýzny pufor (obsahujúci SDS/NaOH).
Buffer P4:neutralizačný pufor.
Vychytávač endotoxínov:účinne odstráni endotoxín zo surového plazmidového extraktu.
Buffer PW:premývacieho pufra, pred prvým použitím pridajte stanovený objem etanolu.
Buffer TB:elučný pufor.
Maxi stĺpce FastPure DNA:adsorpčné kolóny plazmidovej DNA.
Odberové skúmavky 50 ml:skúmavky na zber filtrátu.
Odberná skúmavka bez endotoxínov:skúmavky na odber plazmidovej DNA.
Pripravené materiály
Absolútny etanol, izopropanol, 50 ml centrifugačné skúmavky s guľatým dnom a 50 ml bez endotoxínovodstredivkové skúmavky.
Aplikácie
Tento produkt je vhodný na extrakciu plazmidov vo veľkom meradle zo 150 - 300 ml bakteriálneho roztokukultivované cez noc.
Experimentálny proces
1. Vezmite 150 – 200 ml (nie viac ako 300 ml) bakteriálneho roztoku kultivovaného cez noc a odstreďte pripribližne 11 000 otáčok za minútu (12 000 × g) počas 1 – 2 min.Zlikvidujte supernatant a pozbierajte baktérie.
Δ Pri odbere viac ako 50 ml bakteriálneho roztoku je možné baktérie odobrať pridaním bakteriálneho roztoku, odstredením, odstránením supernatantu a ďalšími krokmi v tej istej 50 ml skúmavke.
viac ráz.
2. Pridajte 7,5 ml tlmivého roztoku P1 (skontrolujte, či sa do tlmivého roztoku P1 pridala RNázaA)skúmavku obsahujúcu baktérie a dôkladne premiešajte vortexom alebo pipetovaním.
Δ Úplná resuspenzia baktérií v tomto kroku je rozhodujúca pre výťažok a po resuspendovaní by nemali byť žiadne zhluky baktérií.Ak existujú bakteriálne zhluky, ktoré nie sú dôkladne premiešané, ovplyvní to lýzu, čo bude mať za následok nízky výťažok a čistotu.Ak je OD600 bakteriálneho roztoku 0,65, pri extrakcii zo 150 ml bakteriálneho roztoku sa odporúča použiť 7,5 ml pufra P1;keď je OD600 0,75, malo by sa použiť 8 ml pufra P1 a objemy pufrov P2 a P4 by sa mali zodpovedajúcim spôsobom zmeniť.Ak sa objem bakteriálneho roztoku zvýši na 200 ml, odporúča saobjem pufrov P1, P2 a P4 proporcionálne zvýšiť.
3. Pridajte 7,5 ml pufra P2 do bakteriálnej suspenzie z kroku 2 a jemne premiešajte hore a dole po dobu 6 – 8krát a inkubujte pri izbovej teplote 4 – 5 minút.
Δ Jemne prevráťte, aby sa zmes dôkladne premiešala.Vortexovanie spôsobí fragmentáciu genómovej DNA, výsledkom čoho sú fragmenty genómovej DNA v extrahovanom plazmide.V tomto čase sa roztok stáva viskóznym a priesvitným, čo ukazuje, že baktérie boli úplne lyzované.Trvanie by nemalo presiahnuť 5 minút, aby sa zabránilo deštrukcii plazmidov.Ak roztok nie je číry, môže byť výsledkom príliš veľa baktériíneúplná lýza, takže množstvo baktérií by sa malo primerane znížiť.
4. Pridajte 7,5 ml tlmivého roztoku P4 do bakteriálnej suspenzie z kroku 3 a ihneď jemne prevráťte 6 – 8-krát, aby roztok úplne zneutralizoval tlmivý roztok P2.V tomto čase by sa mala objaviť biela vločkovitá zrazenina.Centrifugujte pri viac ako približne 11 000 otáčkach za minútu (12 000 × g) počas 10 – 15 minút, opatrne napipetujte supernatant do novej 50 ml centrifugačnej skúmavky s okrúhlym dnom (samopripravenej) a vyhnite saodsajte plávajúcu bielu zrazeninu.
Δ Pridajte tlmivý roztok P4 a ihneď prevráťte, aby sa dobre premiešal.Skúmavku nechajte odstáť, kým sa biela zrazenina nerozdelí rovnomerne v roztoku, aby sa zabránilo tvorbe lokálnej zrazeniny, ktorá by mohla ovplyvniť neutralizáciu.Ak pred centrifugáciou nie je jednotná biela vločkovitá zrazenina a supernatant nie je po centrifugácii číry, skúmavku možnocentrifugovať ďalších 5 min.
5. Do supernatantu z kroku 4 pridajte 0,1-násobok objemu (10 % objemu supernatantu, asi 2,2 ml) lapača endotoxínu a premiešajte.Umiestnite roztok do ľadového kúpeľa alebo ho vložte do drveného ľadu (alebo chladničky s mrazničkou) na 5 minút, kým sa roztok nezmení zo zakaleného na číry a priehľadný (alebo stálemierne zakalené) a občas niekoľkokrát premiešajte.
Δ Po pridaní lapača endotoxínu do supernatantu sa supernatant zakalí, alesupernatant by mal byť po ochladení v ľadovom kúpeli číry (alebo mierne zakalený).
6. Po umiestnení supernatantu pri izbovej teplote (>25 °C) na 10 – 15 minút sa zakalí akojeho teplota sa zvýši na izbovú teplotu.Potom by sa mal supernatant prevrátiť, aby sa premiešal.
Δ Ak je izbová teplota nižšia alebo chcete skrátiť čas extrakcie, supernatant sa môže inkubovať vo vodnom kúpeli s teplotou 37 ~ 42 ℃ počas 5 – 10 minút a ďalší krok sa môže vykonať po supernatantesa zakalí.
7. Odstreďujte supernatant pri približne 11 000 otáčkach za minútu (12 000 x g) počas 10 minút pri izbovej teplote (teplota musí byť >25 °C), aby sa oddelila fáza.Horná vodná fáza obsahuje DNA, zatiaľ čo spodná vrstva modrej olejovej fázy obsahuje endotoxín a iné nečistoty.PrenesteVodná fáza obsahujúca DNA do novej skúmavky aodstráňte mastnú vrstvu.
Δ Teplota počas odstreďovania musí byť vyššia ako 25 °C, pretože efektívna separácia fáz tomu tak nie jevyskytujú, ak je teplota príliš nízka.
Δ Ak oddelenie fáz nie je účinné, teplotu odstreďovania je možné nastaviť na 30 °C ačas odstreďovania možno predĺžiť na 15 min.
Δ Nevysávajte modrú mastnú vrstvu, pretože obsahuje endotoxín a iné nečistoty.
Mechanizmus
Resuspenzná neutralizácia lýzy
◇ Pridajte 7,5 ml pufra P1
◇ Pridajte 7,5 ml pufra P2
◇ Pridajte 7,5 ml pufra P4
Odstránenie endotoxínu
◇ Pridajte 0,1-násobok objemu supernatantu lapača endotoxínu
Viazanie a pranie
◇ Pridajte 0,5-násobok objemu izopropanolu
◇ Pridajte 10 ml pufra PW
◇ Pridajte 10 ml pufra PW
Elúcia
◇ Pridajte 1 – 2 ml pufra TB alebo ddH2O bez obsahu endotoxínov
