ELISA KIT dvojvláknovej RNA (dsRNA).

Táto súprava je ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) spojená so systémom biotín-streptavidín na kvantitatívne meranie dsRNA s dĺžkou nad 60 párov báz (bp), bez ohľadu na sekvenciu.Platňa bola vopred potiahnutá anti-dsRNA protilátkou.dsRNA prítomná vo vzorke sa pridá a naviaže sa na protilátky potiahnuté na jamkách.A potom sa pridá biotinylovaná anti-dsRNA protilátka a naviaže sa na dsRNA vo vzorke.Po premytí sa pridá HRP-streptavidín a naviaže sa na biotinylovanú anti-dsRNA protilátku.Po inkubácii sa nenaviazaný HRP-streptavidín odmyje.Potom sa pridá roztok substrátu TMB a katalyzuje sa pomocou HRP za vzniku modrého sfarbeného produktu, ktorý sa po pridaní kyslého zastavovacieho roztoku zmenil na žltý.Hustota žltej je úmerná cieľovému množstvu dsRNA zachytenej v platni.Absorbancia sa meria pri 450 nm.

Aplikácia

Táto súprava je určená na kvantitatívne meranie zvyškovej dsRNA.

Komponenty súpravy

Skladovanie a stabilita

1. Pre nepoužitú súpravu: Celú súpravu možno skladovať pri teplote 2~8 °C počas doby použiteľnosti.Pre stabilitu pri skladovaní je potrebné sa vyhnúť silnému svetlu.

2. Pre použitú súpravu: Po otvorení mikroplatničky zakryte nepoužité jamky utesňovačom platničiek a vráťte sa do fóliového vrecka obsahujúceho balenie s vysúšadlom, fóliové vrecko uzavrite zipsom a čo najskôr po použití ho vráťte na teplotu 2~8 °C.Ostatné činidlá by sa mali čo najskôr po použití vrátiť na teplotu 2~8 °C.

Požadované, ale nedodávané materiály

1. Čítačka mikrodoštičiek s filtrom 450 ± 10 nm (lepšie, ak dokáže detekovať pri vlnovej dĺžke 450 a 650 nm).

2. Trepačka mikrodoštičiek.

3. Špičky a centrifugačné skúmavky bez RNázy.

Vývojový diagram operácie

Predtým ako začneš

1. Pred použitím vytemperujte všetky komponenty súpravy a vzorky na izbovú teplotu (18-25 °C).Ak sa súprava nespotrebuje naraz, vyberte prúžky a reagencie len pre súčasný experiment a zvyšné prúžky a reagencie ponechajte v požadovanom stave.

2. Premývací tlmivý roztok: rozrieďte 40 ml 20× koncentrovaného premývacieho tlmivého roztoku so 760 ml deionizovanej alebo destilovanej vody, aby ste pripravili 800 ml 1× premývacieho tlmivého roztoku.

3. Štandard: Pred použitím zásobný roztok krátko odstreďte alebo odstredte.Koncentrácia štyroch štandardov je 5 ng/μl.Pre štandardy UTP a pUTP dsRNA zrieďte zásobný roztok na 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,0312, 0,0156,0 pg/μl tlmivým roztokom STE, aby ste nakreslili štandardnú krivku.Pre štandardy N1-Me-pUTP dsRNA zrieďte zásobný roztok na 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,0312, 0 pg/μl pufrom STE, aby ste nakreslili štandardnú krivku.Pre štandard 5-OMe-UTP dsRNA zrieďte zásobný roztok na 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0 pg/μl pufrom STE, aby ste nakreslili štandardnú krivku.Odporúčame štandardy riediť podľa nasledujúcich tabuliek:

4. Biotinylovaná detekčná protilátka a pracovný roztok HRP-streptavidínu: zásobný roztok pred použitím krátko odstreďte alebo odstreďte.Zrieďte ich na pracovnú koncentráciu riediacim pufrom.

5. Substate TMB: odsajte potrebnú dávku roztoku pomocou sterilizovaných špičiek a nevylievajte zvyšný roztok do liekovky znova.Substate TMB je citlivý na svetlo, nevystavujte substrát TMB svetlu na dlhú dobu.

Pomocou protokolu

1. Určite počet prúžkov potrebných na analýzu.Vložte pásy do rámov na použitie.Zvyšné prúžky doštičiek, ktoré sa nepoužívajú v tomto teste, by sa mali znova zabaliť do vrecka s vysúšadlom.Pevne uzavrite vrecko na uskladnenie v chladničke.

2. Do príslušných jamiek pridajte 100 μl každého z riedení štandardu, slepého pokusu a vzoriek.Zakryte tmelom na dosky.Inkubujte 1 hodinu pri teplote miestnosti s trepaním pri 500 ot./min.Vzorky by mali byť zriedené STE pufrom na vhodnú koncentráciu pre presný test.

3. Krok premývania: Nasajte roztok a premyte 250 μl premývacieho pufra do každej jamky a nechajte 30 sekúnd odstáť.Premývací tlmivý roztok úplne zlikvidujte pricvaknutím platne na savý papier.Úplne umyte 4 krát.

4. Do každej jamky pridajte 100 μl pracovného roztoku biotinylovanej detekčnej protilátky.Zakryte tmelom na dosky.Inkubujte 1 hodinu pri teplote miestnosti s trepaním pri 500 ot./min.

5. Opakujte krok premývania.

6. Do každej jamky pridajte 100 μl pracovného roztoku HRP-streptavidínu.Zakryte tmelom na dosky.Inkubujte 30 minút pri teplote miestnosti s trepaním pri 500 ot./min.

7. Zopakujte krok premývania znova.

8. Do každej jamky pridajte 100 μl roztoku substrátu TMB.Zakryte tmelom na dosky.Inkubujte 30 minút pri teplote miestnosti Chráňte pred svetlom.Kvapalina sa zmení na modrú pridaním roztoku substrátu.

9. Do každej jamky pridajte 50 μl zastavovacieho roztoku.Kvapalina zožltne pridaním zastavovacieho roztoku.Potom spustite čítačku mikrodoštičiek a okamžite vykonajte meranie pri 450 nm.

Výpočet výsledkov

1. Spriemerujte duplicitné hodnoty pre každý štandard, kontrolu a vzorky a odpočítajte priemernú optickú hustotu nulového štandardu.Zostrojte štandardnú krivku s absorbanciou na vertikálnej (Y) osi a koncentráciou dsRNA na horizontálnej (X）osi).

2. Odporúča sa vykonať výpočet pomocou počítačového softvéru na prekladanie kriviek, ako je napríklad curve expert 1.3 alebo ELISA Calc v 5 alebo 4 parametrovom nelineárnom modeli.

Výkon

1. Citlivosť:

spodná hranica detekcie: ≤ 0,001 pg/μL (pre UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (pre 5-OMe-UTP-dsRNA).

dolná hranica kvantifikácie:0,0156 pg/μL (pre UTP-, pUTP-dsRNA),0,0312 pg/μL (pre N1-Me-pUTP-dsRNA),0,0625 pg/μL (pre 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Presnosť: CV intra-testu ≤ 10 %, CV inter-testu ≤ 10 %

3. Obnova: 80%~120%

4. Linearita: 0,0156-0,5 pg/μl (pre UTP-,pUTP-dsRNA) 0,0312-1 pg/μL (pre N1-Me-pUTP dsRNA), 0,0625-1 pg/μl (pre 5-OMe-UTP-dsRNA).

Úvahy

1. Reakčná teplota a čas TMB sú kritické, kontrolujte ich prísne podľa pokynov.

2. Na dosiahnutie dobrej reprodukovateľnosti a citlivosti testu je nevyhnutné správne premytie platní, aby sa odstránili nadbytočné nezreagované činidlá.

3. Všetky reagencie by sa mali pred použitím dôkladne premiešať, aby sa počas pridávania vzorky alebo reagencií nebuchli.

4. Ak sa v koncentrovanom premývacom pufri (20x) vytvorili kryštály, zohrejte na 37 °C a jemne premiešajte, kým sa kryštály úplne nerozpustia.

5. Vyhnite sa testovaniu vzoriek obsahujúcich azid sodný (NaN3), pretože by mohol zničiť aktivitu HRP, čo by malo za následok podhodnotenie množstva dsRNA.

6. Zabráňte kontaminácii RNázou počas testu.

7. Štandard/vzorku, detekčnú protilátku a SA-HRP možno vykonať aj pri teplote miestnosti bez pretrepávania, čo však môže spôsobiť jednonásobné zníženie citlivosti detekcie.Pre tento prípad odporúčame, aby sa štandardy UTP a pUTP dsRNA riedili z 2 pg/μl, štandardy N1-Me-pUTP dsRNA by sa mali riediť z 4 pg/μl a štandard 5-OMe-UTP dsRNA by sa mal riediť z 8 pg/μl.Okrem toho inkubujte pracovný roztok HRP-streptavidínu počas 60 minút pri teplote miestnosti.Nepoužívajte trepačku baniek, pretože trepačka môže viesť k nepresným výsledkom.

Typický výsledok

1. Údaje štandardnej krivky

2. Výpočet štandardnej krivky

3. Rozsah detekcie vložky: 0,0312- 1 pg/μL